Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato
Summary
Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial interação<em> In vivo</em> Na isquemia-reperfusão (IRI) do tecido muscular estriado. Nós aqui fornecer um protocolo detalhado para executar com segurança a técnica e discutir suas aplicações e limitações.
Abstract
Isquemia-reperfusão (IRI) tem sido implicado em uma grande variedade de condições patológicas tais como acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, isquemia intestinal, assim como após o transplante, e cirurgia cardiovascular. 1 reperfusão do tecido isquémico anteriormente, enquanto essencial para a prevenção de irreversível lesão tecidual, elicia inflamação excessiva do tecido afectado. Adjacente à produção de espécies reactivas de oxigénio, activação do sistema do complemento e aumento da permeabilidade microvascular, a activação de leucócitos é um dos agentes princípio na cascata patológico do dano tecidual inflamatória durante a reperfusão. 2, 3 activação dos leucócitos é um processo em várias etapas consistindo de laminagem, adesão firme e transmigração e é mediada por uma interacção complexa entre moléculas de adesão, em resposta a chemoattractants tais como factores do complemento, quimiocinas, ou factor de activação de plaquetas. 4
<p = classe "jove_content"> Enquanto circulante de leucócitos em vénulas pós-capilares é predominantemente mediado pela interacção das selectinas 5 com os seus ligandos de balcão, adesão firme dos leucócitos ao endotélio é-selectina controlada através da ligação a moléculas de adesão intercelular (ICAM) e celular vascular As moléculas de adesão (VCAM). 6, 7Padrão-ouro para a observação em vivo de leucócito-endotelial interação é a técnica de microscopia intravital, descrita pela primeira vez em 1968 8.
Embora vários modelos de IRI (isquemia-reperfusão) têm sido descritos para vários órgãos, 9-12 apenas poucos são adequados para a visualização directa do recrutamento de leucócitos no leito microvascular em um elevado nível de qualidade de imagem. 8
Nós aqui promover a microscopia de epifluorescência intravital digitais da vênula postcapillary na microcirculação cremastéricodo rato 13 como um método conveniente para qualitativamente e quantitativamente analisar o recrutamento de leucócitos para a pesquisa IRI-no tecido do músculo estriado e fornecer um manual detalhado para a realização da técnica. Nós ilustrar ainda mais as armadilhas comuns e fornecer dicas úteis que deverão permitir ao leitor a apreciar verdadeiramente, e executar com segurança o método.
Em um passo a passo protocolo que descrevem como começar com anestesia respiração controlada sob monitorização suficiente para manter o animal anestesiado com firmeza por longos períodos de tempo. Em seguida, descrevem a preparação cremastérico como uma folha fina e plana para a resolução óptica surpreendente e fornecer um protocolo para imagiologia de leucócitos no IRI que tem sido bem estabelecidas nos nossos laboratórios.
Protocol
Discussion
Leucócito-endotelial interacção, a produção de espécies reactivas de oxigénio e de activação do sistema do complemento são as principais características de IRI induzida por disfunção do tecido. 26 microcirculação A do tecido afectado é considerado como o local integral para o início inflamatória. Para além de experimentações ex vivo, tais como ensaios de câmara de fluxo 27, 28, é obrigatória a existência de modelos bem-estabelecidos de imagem intravital para avalia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi suportado por uma concessão do "Deutsche Forschungsgemeinschaft" para SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
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