מיקרוסקופ דיגיטלי intravital epifluorescence של venules postcapillary ב microcirculation cremasteric היא שיטה נוחה להבנה טובה של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל<em> In vivo</em> לפציעה איסכמיה reperfusion (IRI) של רקמת שריר מפוספס. אנחנו כאן לספק פרוטוקול מפורט בצורה בטוחה לבצע את טכניקת ולדון היישומים שלה והמגבלות.
איסכמיה reperfusion פציעה (IRI) היה מעורב במגוון גדול של מצבים פתולוגיים כגון שבץ מוחי, אוטם שריר הלב, איסכמיה במעי, כמו גם בעקבות reperfusion השתלת ניתוח לב וכלי דם 1. של רקמה איסכמית בעבר, בעוד חיוני למניעת בלתי הפיך רקמת פציעה, מעורר דלקת מופרזת של רקמת המושפעת. סמוך הייצור של מינים החמצן מגיב, הפעלה של מערכת המשלים והגדילה את חדירות כלי הדם, את ההפעלה של leukocytes הוא אחד השחקנים עיקרון מפל פתולוגית של נזק לרקמה הדלקתית במהלך reperfusion. 2, 3 הפעלת ליקוציט הוא תהליך רב שלבי הכולל של גלגול, הדבקה איתן גלגול, והוא מתווך על ידי פעילות גומלין בין מולקולות הדבקה בתגובה chemoattractants כגון גורמים משלימים, כמוקינים, או טסיות דם, הפעלת גורם. 4
<p class = "jove_content"> בעוד מתגלגל ליקוציט ב venules postcapillary מתווכת בעיקר עם ligands מרשם שלהם, הדבקה של חברת leukocytes כדי האנדותל הוא selectin מבוקר באמצעות כבילת מולקולות הדבקה אינטר (ICAM) וכלי דם הסלולר על ידי האינטראקציה של selectins 5 מולקולות הדבקה (VCAM). 6, 7תקן הזהב עבור בהתבוננות vivo של אינטראקציה ליקוציט-האנדותל היא טכניקה של מיקרוסקופיה intravital, תוארה לראשונה בשנת 1968. 8
אף על פי מודלים שונים של IRI (איסכמיה reperfusion פציעה) תוארו של איברים שונים, 9-12 רק מעטים מתאימים להדמיה ישירה של גיוס ליקוציט במיטה כלי הדם ברמה גבוהה של איכות התמונה. 8
אנחנו כאן לקדם את מיקרוסקופיה דיגיטלית epifluorescence intravital של ורדיד postcapillary ב microcirculation cremastericשל חולדה 13 כשיטה נוחה איכותית וכמותית לנתח גיוס ליקוציט לחקר-IRI ברקמת השריר מפוספס ולספק מדריך מפורט עבור להשיג את הטכניקה. בנוסף, אנו מדגימים ממכשולים נפוצים ולספק עצות שימושיות אשר צריך לאפשר לקורא להעריך באמת, ובטוח לבצע את השיטה.
בשלב ידי פרוטוקול צעד שאנו מתארים כיצד להתחיל עם הרדמה הנשימה מבוקרת תחת פיקוח מספיק כדי לשמור על בעל החיים מורדם היטב במשך תקופות זמן ארוכות יותר. לאחר מכן, אנו מתארים את הכנת cremasteric כסיד שטוח דק של רזולוציה אופטית יוצאת מן הכלל ולספק פרוטוקול הדמיה ליקוציט ב IRI כי כבר נקבעה גם במעבדות שלנו.
ליקוציט-האנדותל אינטראקציה, הייצור של מינים החמצן מגיב והפעלה של מערכת המשלים הם התכונות העיקריות של תפקוד לקוי של IRI הנגרמת לרקמה. 26 microcirculation הרקמה הפגועה נחשב כאתר נפרד עבור הופעת דלקת. מלבד הניסויים ב vivo לשעבר כגון קאמרית מבחני הזרימה 27, 28 זה חובה ל…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של "דויטשה Forschungsgemeinschaft" כדי SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
Heating pad | Effenberger | 8319 | |
Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
Cover glasses | 32×32 mm | ||
Intravital setup | |||
Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |