En temps réel d'imagerie numérique de leucocytes-endothélial interaction dans l'ischémie-reperfusion (IRI) du muscle Cremaster Rat
Summary
Numérique intravitale microscopie à épifluorescence des veinules post-capillaires de la microcirculation crémastérien est une méthode pratique pour obtenir un aperçu de leucocytes-endothélial interaction<em> In vivo</em> En cas d'ischémie-reperfusion (IRI) du tissu musculaire strié. Nous avons ici de fournir un protocole détaillé pour effectuer en toute sécurité de la technique et de discuter de ses applications et ses limites.
Abstract
D'ischémie-reperfusion (IRI) a été impliqué dans un large éventail de conditions pathologiques telles que l'accident vasculaire cérébral, infarctus du myocarde, l'ischémie intestinale ainsi que suite à la greffe et de la chirurgie cardio-vasculaire. Une reperfusion des tissus ischémiques précédemment, si elle est indispensable pour la prévention de l'irréversible lésion des tissus, provoque une inflammation excessive du tissu affecté. Adjacent à la production d'espèces réactives de l'oxygène, l'activation du système du complément et augmentation de la perméabilité microvasculaire, l'activation des leucocytes est l'un des principaux acteurs dans la cascade pathologique de la lésion tissulaire inflammatoire lors de la reperfusion. 2, 3 l'activation des leucocytes est un processus en plusieurs étapes consistant du matériel, l'adhésion ferme et la transmigration et est médiée par une interaction complexe entre les molécules d'adhérence en réponse à chimiotactiques tels que les facteurs du complément, des chimiokines, ou facteur d'activation plaquettaire 4.
<p class = "jove_content"> Bien roulement des leucocytes dans veinules post-capillaires est principalement médiée par l'interaction des sélectines 5 avec leurs ligands contre, l'adhérence ferme des leucocytes à l'endothélium est la sélectine-contrôlé via une liaison à des molécules d'adhésion intercellulaire (ICAM) et vasculaire cellulaires molécules d'adhésion (VCAM). 6, 7Étalon-or pour la observation in vivo de leucocytes-endothélium interaction est la technique de microscopie intravitale, décrite pour la première en 1968 8.
Bien que différents modèles de l'IRI (ischémie-reperfusion) ont été décrits pour différents organes, 9-12 seulement quelques-uns sont adaptés à la visualisation directe de recrutement des leucocytes dans le lit microvasculaire sur un niveau élevé de qualité de l'image 8.
Nous avons ici de promouvoir le numérique microscopie intravitale épifluorescence de la veinule postcapillaire dans la microcirculation crémastériendu rat 13, comme une méthode pratique pour analyser qualitativement et quantitativement le recrutement des leucocytes pour l'IRI-recherche dans le tissu musculaire strié et de fournir un manuel détaillé pour la réalisation de la technique. Nous illustrons les pièges courants et fournir des conseils utiles qui devraient permettre au lecteur de vraiment apprécier, et effectuer en toute sécurité la méthode.
Dans une étape par étape le protocole que nous dépeignent la façon de commencer avec une anesthésie respiration contrôlée sous surveillance suffisante pour maintenir fermement l'animal anesthésié pendant de longues périodes de temps. Nous décrivons ensuite la préparation crémastérien comme une feuille plate et mince pour la résolution optique exceptionnelle et de fournir un protocole pour l'imagerie des leucocytes dans l'IRI qui a été bien établi dans nos laboratoires.
Protocol
Discussion
Leukocyte-endothélial interaction, de production d'espèces réactives de l'oxygène et l'activation du système du complément sont les principales caractéristiques de la dysfonction des tissus IRI-induite. 26 La microcirculation du tissu affecté est considéré comme le site intégrante de l'apparition inflammatoire. Mis à part des expériences ex vivo tels que des tests de chambre d'écoulement 27, 28, il est obligatoire de fournir des modèles bien établis de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la «Deutsche Forschungsgemeinschaft» pour SU Eisenhardt (AE 866/1-1).
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
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