Это видео демонстрирует протокол применение флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) для идентификации и разделения различных субпопуляций клеток глиобластомы человека основана на частоте деления клеток.
Опухоль неоднородность представляет собой фундаментальную функцию поддержки устойчивости опухолей и представляет собой центральное препятствие для развития терапевтических стратегий 1. Для преодоления проблемы гетерогенности опухоли, она имеет важное значение для разработки тестов и инструментов, позволяющих фенотипические (EPI) генетическая и функциональная идентификация и характеристика опухоли субпопуляции, которые приводят конкретных патологий, болезней и представляют собой клинически значимых целей. В настоящее время хорошо известно, что опухоли проявляют различные суб-фракции клеток с разными частотами деления клеток, и что функциональные критерии быть медленным езда на велосипеде положительно связаны с опухолью возможность формирования нескольких видов рака, включая тех, головного мозга, молочной железы, кожи и поджелудочной железы, а также лейкоза 2-8. Флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) была использована для отслеживания частотным разделением клеток в пробирке и в естественных условиях в кровь тumors и твердые опухоли, такие как глиобластома 2,7,8. Клеточной проникающих нефлуоресцентного про-препарат CFSE преобразуется внутриклеточных эстераз в флуоресцентным соединением, которое сохраняется внутри клеток путем ковалентного связывания с белками через реакцию его сукцинимидил фрагмент с внутриклеточными аминогруппы с образованием стабильных амидных связей 9. Флуоресцентный краситель равномерно распределяется между дочерними клетками при подразделений, ведущих к сокращению вдвое интенсивности флуоресценции с каждым делением клетки. Это позволяет отслеживать клетки тактовую частоту до восьми-десяти раундов деления 10. Мощность удержания CFSE был использован с клетками опухоли головного мозга для выявления и локализации медленно субпопуляции велосипеде (5% лучших красителей сохранив клетки) продемонстрировал быть обогащен в раковых стволовых клеток деятельность 2.
Этот протокол описывает технику окрашивания клеток с CFSE и изоляции отдельных популяций в культуре человеческих глиобластома (GBM)-клеток, полученных из обладающих различной разделение цены с помощью проточной цитометрии 2. Техника служит для выявления и локализации опухоли головного мозга медленно велосипедных популяцию клеток в силу своей способности удерживать CFSE маркировки.
Все большее число исследований показали важность медленного деления полуквартал клеток в раке, которые способствуют образованию опухолей и лечение сопротивлением 2-8. Поэтому очень важно, чтобы описать и стандартизировать экспериментальных методов, позволяющих изучение этой к?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Центром Флориде опухоли головного мозга Исследование, Престон А. Wells младший Центр лечения опухолей мозга и Национального института здоровья (1R21CA141020-01).
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |