Очистка и визуализация липополисахарида из грамотрицательных бактерий горячих водно-фенольной экстракции
Summary
Мы описываем изменение горячей водно-фенольной экстракции способ очистки липополисахарида (ЛПС) из грам-отрицательных бактерий. После извлечения, ЛПС может быть в дальнейшем проанализированы SDS-PAGE и визуализировать прямого окрашивания или Западной иммуноблота.
Abstract
Липополисахарида (ЛПС) является основным компонентом грамотрицательных бактериальных внешней оболочки. Это трехстороннее молекула, состоящая из липидного, который встроен в наружную оболочку, олигосахарид кора и повторяющиеся О-антиген единиц, которые выходят наружу от поверхности клетки 1, 2. LPS является иммунодоминантных молекула, которая имеет важное значение для вирулентности и патогенезе многих видов бактерий, в том числе синегнойной палочки, сальмонелл видов, и кишечная палочка 3-5, и различия в LPS О-антиген состава составляют основу для серотипирования штаммов. LPS участвует в приложении к клеткам хозяина в начале инфекции и обеспечивает защиту от комплемент-опосредованной убийство; штаммы, которые не имеют ЛПС может быть ослаблен на вирулентность 6-8. По этим причинам, важно, чтобы визуализировать ЛПС, в частности, от клинических изолятов. Визуализация LPS бэндинга и признание конкретныхntibodies могут быть полезными инструментами для выявления штамма линий и охарактеризовать различные мутанты.
В этом докладе мы описываем горячего водного фенола метод выделения и очистки от ЛПС грам-отрицательных бактерий. Этот протокол позволяет по добыче ЛПС от нуклеиновых кислот и белков, которые могут препятствовать визуализации LPS, что происходит с более короткими, менее интенсивными методами добычи 9. LPS подготовлена таким образом, могут быть разделены додецилсульфата натрия (SDS), электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и непосредственно окрашенных использование углеводов / гликопротеин пятна или стандартных методов окрашивания серебром. Многие анти-сывороток LPS содержат антитела, которые перекрестно реагируют с внешней мембранных белков или других целей антигенного, которые могут помешать реактивности наблюдаются следующие Западной иммуноблота в SDS-PAGE разделенных сырой лизатов клеток. Протеазы лечение сырой лизатов клетки сами по себе не всегда является эффективным способом устранения этогофоновом режиме, используя эту или другие методы визуализации. Кроме того, интенсивное лечение протеазы в попытках удалить этот фон может привести к ухудшению качества LPS, что не очень хорошо решить ни одной из вышеупомянутых методов. По этим причинам мы считаем, что следующий протокол, адаптированный Westpahl и Янн 10, идеально подходит для извлечения ЛПС.
Protocol
Discussion
Мы описали способ очистки LPS от других клеточных компонентов, включая нуклеиновые кислоты и белки. Этот метод обеспечивает высокое качество ЛПС, которые могут использоваться в целом ряде различных методов визуализации, в том числе углеводный окрашивания SDS-PAGE гелей, как показано на рис…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и кистозный фиброз фонда.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
References
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Valvano, M. A. Export of O-specific lipopolysaccharide. Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).
- Pier, G. B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity. Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).
- Freudenberg, M. A. Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria. Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).
- Jann, K., Jann, B. Polysaccharide antigens of Escherichia coli. Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).
- McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing. Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).
- Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains. Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).
- Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins. Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).
- Hitchcock, P. J., Brown, T. M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).
- Westphal, O., Jann, K. Bacterial lipopolysaccharides. Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).
- Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. Nat Genet. , (2011).
