핫 수성 - 페놀 추출에 의한 그람 음성 박테리아에서 정화와 Lipopolysaccharide의 시각화
Summary
우리는 그람 음성 세균의 lipopolysaccharide을 (LPS) 정화를위한 수정된 뜨거운 수성 – 페놀 추출 방법을 설명합니다. 일단 압축을 푼, LPS는 연속적으로 SDS-PAGE에 의해 분석 및 직접 염색법이나 서양 immunoblot에 의해 시각하실 수 있습니다.
Abstract
Lipopolysaccharide가 (LPS) 그람 음성 세균의 외부 세포막의 주요 구성 요소입니다. 그것은 지방질로 구성된 삼자 간의 분자는 외부 세포막에 박혀있는, 셀 1, 2의 표면에서 바깥쪽을 확장하는 핵심 올리 고당 및 반복 O-항원 단위. LPS는 녹농균, 살모넬라균 종, 그리고 대장균 3-5 및 LPS O-항원 구성 양식 종자의 serotyping의 기초의 차이 등 많은 세균 종의 독성 및 pathogenesis에 중요 immunodominant 분자이다. LPS는 감염의 개시에 세포를 호스트 첨부에 참여하고 보완 – 중재 죽이는에서 보호를 제공합니다; LPS 부족 변종은 독성 6-8에 대한 감쇠가 될 수 있습니다. 이러한 이유로, 그것은 특히 임상 분리에서 LPS를 시각화하는 것이 중요합니다. 특정 의해 패턴과 인식을 banding 떠올리 LPSntibodies는 스트레인 lineages를 식별할 수 있도록, 다양한 돌연변이를 특성화하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다.
이 보고서에서 우리는 그람 음성 박테리아 세포에서 LPS의 분리 및 정제를위한 고온 수성 – 페놀 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 멀리 구 짧고 덜 집약적인 추출 방법으로 발생 LPS의 시각화를 방해할 수있는 핵산과 단백질에서 LPS의 추출을 허용합니다. LPS이 방법은 탄수화물 / 당단백질 얼룩 또는 표준 실버 염색법 방법을 사용하여 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)-polyacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)와 직접 스테인드으로 구분됩니다 준비. LPS로 방지 세라 많은 저해 수있는 외부 막 단백질이나 다른 antigenic 목표와 교차 반응 반응은 SDS-PAGE로 구분 원유 세포 lysates의 서양 immunoblot에 따라 관찰되는 항체가 포함되어 있습니다. 혼자 원유 세포 lysates의 단백 분해 효소 처리는 항상 이것을 제거하는 효과적인 방법 없습니다이 문서나 다른 시각화 방법을 사용하여 배경. 또한, 이러한 배경을 제거하기 위해 광범위한 단백 분해 효소 처리가 잘 앞서 언급한 방법 중 하나가 해결되지 품질의 LPS로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 Westpahl 및 Jann 10 일부터 맞게 다음과 같은 프로토콜, LPS 추출에 이상적이라고 생각합니다.
Protocol
Discussion
우리는 핵산과 단백질 등 다른 세포 구성 요소에서 LPS를 멀리 정화하는 방법을 설명했습니다. 이 방법은 그림 1에 표시된 SDS-PAGE의 젤의 탄수화물의 염색법을 포함한 다양한 시각화 방법, 다수에서 사용할 수있는 고품질의 LPS를 제공합니다. 이 방법은 특정 안티 세라를 사용하여 종자의 다양한 LPS를 혈청형하거나 직접 시각화하여 분리 사이 relatedness을 표시하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강과 낭성 섬유증 재단의 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 04716728001 |
| RNase A | Roche | 10109169001 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700 |
| Tris-Saturated Phenol | Fisher | BP1750-100 |
| Diethyl Ether | Thomas Scientific | C313K31 |
| Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Molecular Probes | P20495 |
References
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Valvano, M. A. Export of O-specific lipopolysaccharide. Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).
- Pier, G. B. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity. Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).
- Freudenberg, M. A. Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria. Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).
- Jann, K., Jann, B. Polysaccharide antigens of Escherichia coli. Rev. Infect. Dis. 9, S517-S526 (1987).
- McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing. Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).
- Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains. Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).
- Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins. Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).
- Hitchcock, P. J., Brown, T. M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).
- Westphal, O., Jann, K. Bacterial lipopolysaccharides. Methods Carbohyr. Chem. 5, 83 (1965).
- Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. Nat Genet. , (2011).
