Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Summary

Wij beschrijven een gemodificeerd hot waterige fenol extractie werkwijze voor het zuiveren lipopolysaccharide (LPS) van Gram-negatieve bacteriën. Afgetapt kan de LPS vervolgens geanalyseerd door SDS-PAGE en gevisualiseerd door directe kleuring of Western immunoblot.

Abstract

Lipopolysaccharide (LPS) is een belangrijk onderdeel van Gram-negatieve bacteriën buitenste membranen. Het is een drieledige molecuul dat uit lipide A, die ingebed is in de buitenste membraan, een kern oligosaccharide en het herhalen O-antigeen eenheden die buiten uitstrekken vanaf het oppervlak van de cel ^{1, 2.} LPS is een immunodominante molecule die belangrijk is voor de virulentie en Pathogenese van vele soorten bacteriën, zoals Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, en Escherichia coli ^3-5, en verschillen in LPS O-antigen samenstelling vormen de basis voor serotypering stammen. LPS is betrokken bij de gehechtheid aan gastheercellen aan het begin van de infectie en biedt bescherming tegen complement-gemedieerde doden; stammen die LPS missen kunnen worden verminderd voor de virulentie ^6-8. Daarom is het belangrijk om LPS te visualiseren name van klinische isolaten. Het visualiseren van LPS banding patronen en erkenning door middel van specifieke eenntibodies kan nuttig zijn hulpmiddelen om stam lijnen te identificeren en om de verschillende mutanten te karakteriseren.

In dit verslag beschrijven we een hete waterige fenol werkwijze voor de isolatie en zuivering van LPS van Gram-negatieve bacteriële cellen. Dit protocol kan de extractie van LPS afstand van nucleïnezuren en eiwitten die interfereren met visualisatie van LPS dat optreedt bij kortere minder intensieve winningsmethoden ^9. LPS deze wijze bereid kunnen worden gescheiden natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) en direct gekleurd met koolhydraten / glycoproteïne vlekken of standaard zilverkleuring methoden. Veel anti-sera aan LPS bevatten antilichamen die kruisreageren met buitenste membraan eiwitten of andere antigene doelen die kunnen hinderen reactiviteit waargenomen na West-immunoblot van SDS-PAGE gescheiden ruwe cellysaten. Protease behandeling van ruwe cellysaten alleen is niet altijd een effectieve manier van verwijderen van dezeachtergrond met behulp van deze of andere visualisatie methoden. Verder kan uitgebreid protease behandeling in een poging om deze achtergrond verwijderen tot slechte kwaliteit LPS dat niet goed is opgelost door elk van de bovengenoemde methoden. Om deze redenen zijn wij van mening dat de volgende protocol, aangepast van Westpahl en Jann ^10, is ideaal voor LPS extractie.

Protocol

1. Voorbereiding van bacteriën voor LPS Extraction Start een nacht cultuur in 5 ml Luria Broth (LB), aangevuld met antibiotica indien nodig. Groei cultuur overnacht (12-18 uur) in een schudincubator bij 37 ° C en 200 rpm. Verdun de cultuur 1:10 met LB en neem een OD 600 lezing in een spectrofotometer. Op basis van de OD 600 lezen, maak dan een 1,5 ml schorsing van uw bacteriën om een OD 600 van 0,5. Pellet de bacteriën in een microcentrifuge bij 10.600 …

Discussion

Wij hebben een werkwijze beschreven voor het zuiveren van LPS afstand van andere cellulaire componenten, zoals nucleïnezuren en eiwitten. Deze methode levert hoogwaardige LPS die gebruikt kunnen worden in verschillende gebruikelijke methoden, zoals koolhydraten kleuring van SDS-PAGE gels, zoals weergegeven in figuur 1. Deze methode kan worden gebruikt om LPS serotype van verschillende stammen, met specifieke antisera, of verwantschap tonen tussen isolaten door directe visualisatie. Bijvoorbeeld, een recente genoom-bred…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	04716728001
RNase A	Roche	10109169001
Proteinase K	Fisher	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes	P20495