Summary

'Tek Virüs Genomik' kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Published: May 26, 2013
doi:

Summary

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

Abstract

Tek mikrobiyal hücrelerin tüm genom amplifikasyon ve sıralama ekimi 1-3 en gerek kalmadan genomik karakterizasyonu sağlar. Her yerde ve gezegenimizin 4 üzerindeki en çok sayıda varlıklar ve tüm ortamlarda 5 içinde önemli olan Virüsler,, benzer yaklaşımlar yoluyla ortaya çıkmak için henüz. Burada 'Tek Kişilik Virüs Genomik' (SVG) adı verilen tek virionlar genom izole ve karakterize için bir yaklaşım tarif. SVG daha sonraki dizi analizi reaksiyonlar otelinin ikinci el kullanılabilen, yüksek molekül ağırlığı genomik DNA (gDNA) elde etmek üzere tek tek virüs ve Bütün Genom Dizileme Sistemi amplifikasyon izole etmek için akım sitometri kullanır.

Protocol

1. Viral süspansiyonlar, bölgesinin hazırlanması Akım sitometri yöntemiyle tek bir virionlar izolasyonu önce, sabitlenmemiş viral süspansiyonlar hazırlamak. Emin yarıyıl sonu viral bir askıya alma yapma daha önce belirlenmiş olan iletişim kuralları'nı kullanarak viral partiküller izole edin 0.1 'de içerdiği almaktadır mikron-süzüldü Yatay aralık TE (Tris-EDTA, pH 8). Diğer yöntemler söz konusu kullanım kimyasal flokülasyon 7 geliş…

Discussion

SVG yaklaşımlar uygularken önemli bir dizi faktör dikkate alınmalıdır. Genotipleme, proof-of-concept deney 13 sırasında yapılan gibi, korunmuş astarlar tüm viral gruplarında mevcut değildir gibi çevresel veya bilinmeyen izolatların için geçerli bir seçenek değil. Ayrıca, arka plan DNA sentezi ya da spesifik olmayan amplifikasyon sık MDA reaksiyon 14 kullanılarak amplifikasyon sırasında bildirilir. Spesifik olmayan amplifikasyon reaksiyonu reaktif maddeler ve / veya reaksiyo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yazının hazırlık süreci boyunca onun fikir ve tavsiye için Ken Nealson teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Material Name Company Catalogue Number Comments
1X TE buffer Invitrogen 12090-015  
Buffer-saturated Phenol Invitrogen 15513-039  
GenomiPhi HY kit GE Healthcare 25-6600-22  
Glycoblue Invitrogen AM9516 15 mg/ml
LMP agarose Invitrogen 16520100  
PTFE microscope slide Electron Microscopy Sciences 63430-04 24 well, 4 mm Diameter
SybrGreen Invitrogen S7585 10,000X
β-agarase New England Biolabs M0392S  

References

  1. Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
  2. Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
  3. Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
  4. Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
  5. Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
  6. Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
  7. John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
  8. Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
  9. Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
  10. Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
  11. Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
  12. Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
  13. Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
  14. Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).

Play Video

Cite This Article
Zeigler Allen, L., Ishoey, T., Novotny, M. A., McLean, J. S., Lasken, R. S., Williamson, S. J. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using ‘Single Virus Genomics’. J. Vis. Exp. (75), e3899, doi:10.3791/3899 (2013).

View Video