Summary

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit 'Single Virus Genomics'

Published: May 26, 2013
doi:

Summary

Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung geeignete ist.

Abstract

Amplifikation des gesamten Genoms und Aneinanderreihung einzelner mikrobiellen Zellen ermöglicht Genoms ohne die Notwendigkeit des Anbaus 1-3. Viren, die allgegenwärtig und die meisten zahlreiche Unternehmen auf unserem Planeten 4 und wichtig in allen Umgebungen 5 sind, müssen noch über ähnliche Ansätze aufgedeckt werden. Hier beschreiben wir einen Ansatz für die Isolierung und Charakterisierung der Genome einzelner Virionen genannt 'Single Virus Genomics "(SVG). SVG verwendet Durchflusszytometrie einzelnen Viren, Amplifikation des gesamten Genoms zu isolieren, um hochmolekulare genomische DNA (gDNA), die in nachfolgenden Reaktionen Sequenzierung verwendet werden können erhalten.

Protocol

1. Herstellung von Virussuspensionen Vor Isolierung einzelner Virionen über Durchflusszytometrie, bereiten fixierten Virussuspensionen. Isolieren Viruspartikel mit vorher etablierten Protokollen sicherstellen endgültigen Virussuspension wird in 0,1 enthielt um filtriert TE (Tris-EDTA, pH 8). Wir empfehlen die Verwendung Tangentialflussfiltration (TFF) nähert 6 obwohl andere Methoden entwickelt wurden, die Verwendung chemischer Flockung 7. Aufzäh…

Discussion

Eine Vielzahl wichtiger Faktoren müssen berücksichtigt werden, wenn die Anwendung SVG Ansätze. Genotypisierung, so wurde während des Proof-of-Concept-Experiment 13 durchgeführt wird, ist keine gültige Option für die Umwelt oder die unbekannten Isolate als konservierte Primer nicht verfügbar sind, in allen viralen Gruppen. Auch ist Hintergrund DNA-Synthese oder unspezifische Amplifikation häufig während der Amplifikation mit dem MDA-Reaktion 14 gemeldet. Die unspezifische Amplifikation kon…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Ken Nealson für seine Einsicht und Beratung während des Manuskripts Prozess danken.

Materials

Material Name Company Catalogue Number Comments
1X TE buffer Invitrogen 12090-015  
Buffer-saturated Phenol Invitrogen 15513-039  
GenomiPhi HY kit GE Healthcare 25-6600-22  
Glycoblue Invitrogen AM9516 15 mg/ml
LMP agarose Invitrogen 16520100  
PTFE microscope slide Electron Microscopy Sciences 63430-04 24 well, 4 mm Diameter
SybrGreen Invitrogen S7585 10,000X
β-agarase New England Biolabs M0392S  

References

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Cite This Article
Zeigler Allen, L., Ishoey, T., Novotny, M. A., McLean, J. S., Lasken, R. S., Williamson, S. J. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using ‘Single Virus Genomics’. J. Vis. Exp. (75), e3899, doi:10.3791/3899 (2013).

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