Summary

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Published: February 15, 2012
doi:

Summary

Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico da tuberculose humana, tem uma capacidade extraordinária para sobreviver contra estresses ambientais, incluindo antibióticos. Embora a tolerância ao estresse de M. tuberculose é um dos provavelmente contribui para a quimioterapia 6-mês longo da tuberculose 1, os mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo característica do agente patogénico permanecem incertos. Muitas espécies microbianas evoluíram para sobreviver em ambientes estressantes por auto-montagem em superfície altamente organizada, em anexo, e estruturas matriciais encapsulados chamados biofilmes 2-4. Crescimento em comunidades parece ser uma estratégia de sobrevivência preferida de micróbios, e é conseguida por meio de componentes genéticos que regulam fixação superfície, as comunicações intercelulares, e síntese de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) 5,6. A tolerância ao estresse ambiental é provavelmente facilitada pela EPS, e talvez pelo fisiolóadaptação tecnológico de bacilos indivíduo a microambientes heterogêneos dentro da complexa arquitetura de biofilmes 7.

Em uma série de trabalhos recentes, estabeleceu que M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis têm uma forte propensão para crescer em organizados estruturas multicelulares, chamado biofilmes, que pode tolerar mais de 50 vezes as concentrações inibitórias mínimas das drogas anti-tuberculose isoniazida e rifampicina 8-10. M. tuberculose, no entanto, intrigantemente requer condições específicas para formar biofilmes maduros, em proporção de 9:1 particular de headspace: meios bem como a troca limitada de ar com a atmosfera 9. Requisitos de especializados condições ambientais poderia possivelmente ser ligada ao facto de que a M. tuberculosis é um patógeno humano obrigatório e, portanto, se adaptou aos ambientes de tecido. Nesta publicação, demonstrar os métodos para cultura de M. tuberculosebiofilme em uma garrafa e um formato de placa de 12 poços, que é conveniente para estudos bacteriológicos, bem como genéticos. Nós descrevemos o protocolo para uma estirpe atenuada de M. tuberculose, mc dois 7000, com supressão nos dois loci, panCD e RD1, que são críticas para crescimento in vivo do agente patogénico 9. Esta variedade pode ser usado com segurança em uma contenção BSL-2 para a compreensão da biologia básica do patógeno tuberculose, evitando assim a exigência de uma instalação de BSL-3 caro. O método pode ser estendida, com modificação adequada em meios de comunicação, a crescer biofilme de outras espécies de micobactérias cultiváveis.

Em geral, um protocolo uniforme de biofilmes cultura de micobactérias vai ajudar os pesquisadores interessados ​​em estudar as características básicas resistentes de micobactérias. Além disso, um método claro e conciso do crescimento de biofilmes de micobactérias também irá ajudar o inv clínica e farmacêuticaestigators para testar a eficácia de um fármaco potencial.

Protocol

1. Biofilmes de crescimento de M. tuberculose em uma garrafa de 250 ml com tampa de rosca Preparação Media: Dissolver 0,5 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de MgSO4, 4g de L-asparagina, 2g de ácido cítrico, 0,05 g de citrato de amónio férrico, 60mL de glicerol em 900ml de água. Ajustar o pH a 7,0 com NaOH. Autoclave, arrefecer e imediatamente antes de se iniciar a experiência, adicionar ZnSO estéril 4 a uma concentração final de 0,1% w / v Desde mc …

Discussion

A tuberculose (TB), causada pela infecção do Mycobacterium tuberculosis, continua a ser uma grande ameaça à saúde pública global. Quase um terço da população mundial é estimada para ser assintomática infectada pelo patógeno, cerca de 9 milhões de novos casos aparecem na clínica todos os anos com sintomas de tuberculose ativa e cerca de 1,7 milhões morrem da infecção a cada ano 11. O enorme fardo da doença é essencialmente contribuído por falta de uma vacina e uma quimioterapia mui…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho foi realizado com apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde e American Lung Association.

Materials

Equipment and supplies SUPPLIER CATALOG NUMBER
Incubator VWR Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles Fisher Scientific 03-374-300
12-well tissue culture plate VWR 62406-165
50-mL conical tubes VWR 89039-660
Rocker Thermo Scientific 57019-662
Chromatographic refrigerator VWR 55702-520
petri dish VWR 25384-342
     
REAGENT SUPPLIER CATALOG NUMBER
KH2PO4 (monobasic) EMD PX1565-1
MgSO4 Fisher M65-500
L-asparagine Sigma A4284-100G
citric acid Sigma C1857-100G
ferric ammonium citrate Sigma F5879-100G
glycerol EMD GX0185-5
NaOH Sigma S8045-500G
ZnSO4 Sigma Z4750-500G
D-pantothenic acid Sigma P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth Becton Dickinson 271310
Middlebrook OADC Enrichment BBL 212351
Tween-80 Fisher T164-500
250mL storage bottle Corning 430281
12 well plates Falcon (BD) 353043
rifampicin Sigma R3501-1G
methanol J.T. Baker 9070-05
10mlLsyringe Becton Dickinson 301604
1-200μL pipet tips VWR 89079-458
parafilm M VWR PM-996
15mL centrifuge tube Greiner Bio-One 188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar Becton Dickinson 283810
NaCl Fisher BP358-1
KCl Sigma P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic) Sigma S0876-500G

References

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Cite This Article
Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms. J. Vis. Exp. (60), e3820, doi:10.3791/3820 (2012).

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