La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms
Summary
Mycobacterium tuberculosis forme des biofilms de drogues tolérantes quand elles sont cultivées dans certaines conditions. Nous décrivons ici les méthodes de culture, M. biofilms tuberculose et la détermination de la fréquence des persistants de drogue tolérante. Ces protocoles seront utiles pour d'autres études sur les mécanismes de la tolérance au médicament chez M. la tuberculose.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose humaine, a une capacité extraordinaire de survivre contre les stress environnementaux, notamment des antibiotiques. Bien que la tolérance au stress de M. la tuberculose est l'une des contributeurs susceptibles à la chimiothérapie de 6 mois à long de la tuberculose 1, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce phénotype caractéristique de l'agent pathogène restent floues. Beaucoup d'espèces microbiennes ont évolué pour survivre dans des environnements stressants par auto-assemblage en très organisée, la surface fixée, et la matrice des structures encapsulées appelé biofilms 2-4. La croissance dans les collectivités qui semble être une stratégie de survie préféré des microbes, et est réalisé grâce à des composants génétiques qui régulent la surface de fixation, les communications intercellulaires, et la synthèse de substances polymériques extracellulaires (EPS) 5,6. La tolérance au stress environnemental est probablement facilité par EPS, et peut-être par le physiol'adaptation logique de bacilles individu à microenvironnements hétérogènes au sein de l'architecture complexe des biofilms 7.
Dans une série d'articles récents, nous avons établi que M. la tuberculose et le Mycobacterium smegmatis ont une forte propension à se développer dans des structures multicellulaires organisés, appelés biofilms, qui peuvent tolérer plus de 50 fois les concentrations minimales inhibitrices des médicaments anti-tuberculeux isoniazide et 8-10 rifampicine. M. la tuberculose, cependant, nécessite curieusement conditions spécifiques à former des biofilms matures, en particulier de rapport de 9:01 espace de tête: les médias ainsi que l'échange limité de l'air avec l'atmosphère 9. Exigences de conditions environnementales spécialisées pourrait être lié au fait que M. la tuberculose est un agent pathogène obligatoire humaine et a donc adapté aux environnements de tissus. Dans cette publication, nous la démonstration de méthodes de culture de M. tuberculosebiofilms dans une bouteille et un format de plaque à 12 puits, ce qui est pratique pour les études bactériologiques ainsi que génétiques. Nous avons décrit le protocole d'une souche atténuée de M. la tuberculose, mc 2 7000, avec la suppression dans les deux locus, panCD et RD1, qui sont cruciaux pour la croissance in vivo de la 9 pathogène. Cette souche peut être utilisé sans danger dans une enceinte BSL-2 pour la compréhension de la biologie de base de l'agent pathogène tuberculose évitant ainsi l'exigence d'un coûteux BSL-3 installation. La méthode peut être étendue, moyennant des modifications appropriées dans les médias, à se développer un biofilm d'autres espèces de mycobactéries cultivables.
Dans l'ensemble, un protocole uniforme de biofilms culture mycobactérienne aidera les enquêteurs s'intéressent à l'étude des caractéristiques de base élastiques de mycobactéries. En outre, une méthode claire et concise de la croissance des biofilms mycobactériens aidera également le inv clinique et pharmaceutiqueestigators pour tester l'efficacité d'un médicament potentiel.
Protocol
Discussion
La tuberculose (TB), causée par l'infection de Mycobacterium tuberculosis, demeure une menace majeure pour la santé publique mondiale. Près d'un tiers de la population mondiale est estimée à asymptomatique infecté par l'agent pathogène, environ 9 millions de nouveaux cas apparaissent chaque année dans la clinique avec des symptômes de tuberculose évolutive et environ 1,7 million de personnes meurent de l'infection chaque année 11. Le lourd fardeau de la maladie est principa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été réalisé avec le soutien financier de l'Institut national de la Santé et l'American Lung Association.
Materials
| Equipment and supplies | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| Incubator | VWR | Model # 1923/25 |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 |
| 12-well tissue culture plate | VWR | 62406-165 |
| 50-mL conical tubes | VWR | 89039-660 |
| Rocker | Thermo Scientific | 57019-662 |
| Chromatographic refrigerator | VWR | 55702-520 |
| petri dish | VWR | 25384-342 |
| REAGENT | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD | PX1565-1 |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 |
| L-asparagine | Sigma | A4284-100G |
| citric acid | Sigma | C1857-100G |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879-100G |
| glycerol | EMD | GX0185-5 |
| NaOH | Sigma | S8045-500G |
| ZnSO4 | Sigma | Z4750-500G |
| D-pantothenic acid | Sigma | P2250-25G |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | Becton Dickinson | 271310 |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 |
| Tween-80 | Fisher | T164-500 |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 |
| 12 well plates | Falcon (BD) | 353043 |
| rifampicin | Sigma | R3501-1G |
| methanol | J.T. Baker | 9070-05 |
| 10mlLsyringe | Becton Dickinson | 301604 |
| 1-200μL pipet tips | VWR | 89079-458 |
| parafilm M | VWR | PM-996 |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | Becton Dickinson | 283810 |
| NaCl | Fisher | BP358-1 |
| KCl | Sigma | P9333-500G |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma | S0876-500G |
References
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