Um método para gerar células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de expressão retrovírus mediada ectópica de Oct4, SOX2, KLF4 e MYC é descrito. Uma maneira prática de identificar humanos colônias de IPSC com base na expressão de GFP também é discutida.
Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) são pluripotentes e uma fonte de valor inestimável para celulares in vitro de modelagem de doenças e medicina regenerativa 1. Já foi demonstrado que as células somáticas humanas pode ser reprogramado para pluripotência pela expressão ectópica dos quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, KLF4 e Myc) e tornar-se células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 2-4. Como hESCs, iPSCs humanas são pluripotentes e uma fonte potencial de células autólogas. Aqui nós descrevemos o protocolo de reprogramar células de fibroblastos humanos, com os quatro fatores de reprogramação clonados em GFP contendo backbone retroviral 4. Usando o protocolo seguinte, geramos iPSCs humanos em 3-4 semanas sob condições de cultura humana ESC. Colónias humanos IPSC se assemelham hESCs na morfologia e exibir a perda de fluorescência da GFP como um resultado de silenciamento do transgene retroviral. IPSC colônias isoladas mecanicamente sob microscopia de fluorescênciaep comportar-se de uma maneira semelhante à hESCs. Nestas células, nós detectar a expressão de vários genes pluripotência e marcadores de superfície.
Expressão de quatro fatores de transcrição reprograma fibroblastos humanos para iPSCs. Muitas tentativas foram feitas para gerar iPSCs humanos utilizando abordagens não integradoras ou não-genética para gerar iPSCs clinicamente seguros. Até agora, esses métodos mostram eficiência extremamente baixa e exigem otimização para melhorar a reprodutibilidade 11-14. Métodos de retro-ou lentiviral são prontamente utilizados para obter e aplicar iPSCs para o homem em modelos de doenças <…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Yale School of Medicine e Prêmio Criança Pesquisa em Saúde da Fundação Charles capa.
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
hESC medium | |||
DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Fiboblasts Medium | |||
DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
Antibodies | |||
OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
Plasmids | |||
pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
Other Materials | |||
Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Equipment | |||
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter |
Table 2. Reagents and equipment.