Un metodo per generare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) tramite retrovirus-mediata espressione ectopica di Oct4, Sox2, Klf4 e MYC è descritto. Un modo pratico per identificare umani IPSC colonie sulla base di GFP è anche discusso.
Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono pluripotenti e una fonte inestimabile per cellulari in vitro modelli di malattia e della medicina rigenerativa 1. E 'stato precedentemente dimostrato che cellule somatiche umane può essere riprogrammato per pluripotenza dall'espressione ectopica di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4 e Myc) e diventare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 2-4. Come hESC, iPSCs umani sono pluripotenti e una fonte potenziale di cellule autologhe. Qui descriviamo il protocollo per riprogrammare cellule di fibroblasti umani con i quattro fattori di riprogrammazione clonati in GFP-retrovirale contenente backbone 4. Utilizzando il seguente protocollo, generiamo iPSCs umani in 3-4 settimane sotto condizione umana della cultura ESC. Umani colonie IPSC assomigliano hESC nella morfologia e visualizzare la perdita di fluorescenza GFP come risultato di silenziamento del transgene retrovirale. colonie IPSC isolato meccanicamente con un microsco fluorescenzape si comportano in modo simile a come hESC. In queste cellule, si rileva l'espressione di geni multipli pluripotenziali e marcatori di superficie.
Espressione di quattro fattori di trascrizione riprogramma i fibroblasti umani a iPSCs. Molti tentativi sono stati fatti per generare iPSCs umani utilizzando non-integrazione o non-genetica approcci per generare iPSCs clinicamente sicuro. Finora, questi metodi presentano efficienza estremamente bassa e richiedono ulteriore ottimizzazione per migliorare la riproducibilità 11-14. Metodi Retro-o lentivirali sono facilmente utilizzati per ricavare e applicare iPSCs per l'uomo in modelli di malattia …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dalla Yale School of Medicine e Salute Child Research Award da Charles Hood Foundation.
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
hESC medium | |||
DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Fiboblasts Medium | |||
DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
Antibodies | |||
OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
Plasmids | |||
pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
Other Materials | |||
Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Equipment | |||
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter |
Table 2. Reagents and equipment.