שיטה ליצירת אדם המושרה גזע pluripotent תאים (iPSCs) דרך לביטוי רטרווירוס בתיווך חוץ רחמי של OCT4, Sox2, KLF4 ו myc מתואר. באופן מעשי לזיהוי מושבות iPSC אדם המבוססים על ביטוי של GFP נדון גם.
בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הם pluripotent ו כ מקורות הסלולר שלא יסולא בפז עבור בדוגמנות המחלה במבחנה ברפואה רגנרטיבית 1. הוכח בעבר כי האדם תאים סומטיים ניתן לתכנות מחדש כדי pluripotency ידי ביטוי אקטופי של ארבעה גורמי תעתוק (Oct4, Sox2, Klf4 ו myc) ולהיות המושרה על גזע pluripotent תאים (iPSCs) 2-4. כמו hESCs, iPSCs האדם pluripotent ומקור פוטנציאל תאים עצמיים. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לתכנת מחדש תאים פיברובלסטים אדם עם ארבעה גורמים תכנות מחדש משובטים לתוך עמוד השדרה-GFP המכיל retroviral 4. באמצעות פרוטוקול הבאה, אנחנו מייצרים iPSCs האדם 3-4 שבועות בתנאי ESC התרבות האנושית. אדם מושבות iPSC דומים hESCs ב המורפולוגיה להציג הפסד של ה-GFP הקרינה כתוצאה ההשתקה transgene retroviral. מושבות iPSC מבודדים מכנית תחת microsco הקרינהPE להתנהג באופן דומה hESCs. בתאים אלה, אנו מזהים את הביטוי של גנים pluripotency מספר סמנים פני השטח.
הביטוי של ארבעה גורמי תעתוק fibroblasts reprograms אדם עד iPSCs. ניסיונות רבים נעשו כדי לייצר iPSCs אדם באמצעות שילוב גישות שאינם או לא גנטית כדי לייצר iPSCs בטוח מבחינה רפואית. עד כה שיטות אלה מראים יעילות נמוכה מאוד ודורשים אופטימיזציה נוספת כדי לשפר את שחזור 11-14. שיטות רטרו או l…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל ובריאות הילד פרס מחקר של קרן צ'רלס הוד.
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
hESC medium | |||
DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Fiboblasts Medium | |||
DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
Antibodies | |||
OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
Plasmids | |||
pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
Other Materials | |||
Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Equipment | |||
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter |
Table 2. Reagents and equipment.