Summary

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Published: February 15, 2012
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Summary

Biofilmes microbianos são geralmente constituídos por subpopulações distintas de células especializadas. De célula única análise destas subpopulações requer a utilização de repórteres fluorescentes. Aqui nós descrevemos um protocolo para visualizar e monitorar vários subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilmes através de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.

Abstract

Formação de biofilme é um atributo geral para quase todos 1-6 bactérias. Quando as bactérias formar biofilmes, as células são encerradas em matriz extracelular que é principalmente constituída por proteínas e exopolissacarídeos, entre outros factores 7-10. A comunidade microbiana encaixada dentro do biofilme, muitas vezes mostra a diferenciação de subpopulação distinta de células especializadas 11-17. Estas subpopulações coexistir e muitas vezes mostram organização espacial e temporal dentro do biofilme 18-21.

A formação de biofilme no modelo de Bacillus subtilis organismo requer a diferenciação de subpopulações distintas de células especializadas. Entre eles, a subpopulação de produtores de matriz, responsáveis ​​para produzir e secretar a matriz extracelular do biofilme é essencial para a formação de biofilme 11,19. Assim, a diferenciação dos produtores de matrizes é uma característica da formação de biofilme em B. subtilis.

Usámos repórteres fluorescentes para visualizar e quantificar a subpopulação de produtores de matriz em biofilmes de B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, observou-se que a subpopulação de produtores de matriz diferencia em resposta à presença de auto-produzido sinal extracelular surfactina 25. Curiosamente, surfactina é produzida por uma subpopulação de células especializadas diferentes a partir da subpopulação de produtores de matriz 15.

Temos detalhadas neste relatório a abordagem técnica necessária para visualizar e quantificar a subpopulação de produtores de matrizes e produtores surfactina dentro dos biofilmes de B. subtilis. Para fazer isso, repórteres fluorescentes de genes necessários para a produção de matriz e da produção surfactina são inseridos no cromossoma de B. subtilis. Repórteres são expressos apenas em uma subpopulação de células especializadas. Em seguida, as subpopulações pode sermonitorizada utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (ver Fig. 1).

O fato de que diferentes subpopulações de células especializadas coexistir dentro de comunidades multicelulares de bactérias nos dá uma perspectiva diferente sobre a regulação da expressão gênica em procariontes. Este protocolo aborda esse fenômeno experimentalmente e pode ser facilmente adaptado a qualquer modelo de outros, para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à heterogeneidade fenotípica dentro de uma comunidade microbiana.

Protocol

1. Rotulagem B. subtilis e ensaio de formação de biofilme Amplificar por PCR da região promotora do gene de interesse. Nós mostramos como exemplo, a clonagem de P tapa, o promotor dos genes responsáveis ​​pela produção de proteína de matriz Tasa 26. Clone P tapa em pkm008 vetor (criado pelo laboratório Rudner, Harvard Medical School. Boston, EUA) (Fig. 2). Linearizar os plasmídeos por digestão enzimática (Enzyme recomendada,…

Discussion

O fato de que as comunidades bacterianas mostrar subpopulações de células que expressam conjunto específico de genes evidencia a complexidade das comunidades microbianas 33,34. Este protocolo deve ajudar a determinar se a expressão de qualquer gene de interesse é restrita a uma subpopulação específica de células especializadas na comunidade microbiana. Visualização destas subpopulações exige o desenvolvimento de novas técnicas, porque os métodos tradicionais para monitorizar a expressão do ge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é financiado pelo Programa Jovem Investigador de Pesquisa, do Centro de Pesquisas de Doenças Infecciosas (Zinf) da Universidade de Würzburg. Juan C Garcia-Betancur é uma bolsa de doutoramento da Escola de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (GSLs) da Universidade de Würzburg.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar

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Cite This Article
Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).

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