Summary

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Published: February 15, 2012
doi:

Summary

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilmen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie.

Abstract

Biofilm-Bildung ist ein allgemeines Attribut auf fast allen Bakterien 6.1. Wenn Bakterien Biofilme zu bilden, sind Zellen, in der extrazellulären Matrix, die hauptsächlich gebildet wird von Proteinen und Exopolysacchariden, neben anderen Faktoren 7-10 umhüllt. Die mikrobielle eingeschlossen innerhalb der Biofilme häufig zeigt die Differenzierung von unterschiedlichen Subpopulation von spezialisierten Zellen 11-17. Diese Subpopulationen koexistieren und zeigen oft räumliche und zeitliche Organisation innerhalb des Biofilms 18-21.

Biofilm-Bildung in den Modellorganismus Bacillus subtilis erfordert die Differenzierung von Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Unter ihnen ist die Subpopulation der Matrix Hersteller verantwortlich zu produzieren und sezernieren die extrazelluläre Matrix des Biofilms wesentlichen für die Biofilmbildung 11,19. Daher ist die Differenzierung von Matrix-Produzenten ein Markenzeichen der Biofilmbildung bei B. subtilis.

Wir haben fluoreszierenden Reporter zur Visualisierung und Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Produzenten in Biofilmen von B. subtilis 15,19,22-24. Konkret haben wir beobachtet, dass die Subpopulation der Matrix Hersteller in Reaktion auf das Vorhandensein von selbst produzierten extrazelluläres Signal Surfactin 25 unterscheidet. Interessanterweise wird Surfactin von einer Subpopulation von spezialisierten Zellen unterscheidet sich von der Subpopulation von Matrix 15 Herstellern produziert.

Wir haben in diesem Bericht die technischen Ansatz notwendig, visualisieren und quantifizieren die Subpopulation von Matrix-Produzenten und Surfactin Produzenten innerhalb der Biofilme von B. subtilis beschrieben. Um dies zu tun, sind fluoreszierende Reporter von Genen für Matrix-Produktion und die Produktion benötigten Surfactin in das Chromosom von B. eingefügt subtilis. Reporter werden nur in einer Subpopulation von spezialisierten Zellen exprimiert. Dann können die Subpopulationenüberwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (siehe Abb. 1).

Die Tatsache, dass unterschiedliche Subpopulationen von spezialisierten Zellen in vielzelligen Gemeinschaften von Bakterien koexistieren gibt uns eine andere Perspektive über die Regulation der Genexpression in Prokaryoten. Dieses Protokoll befasst sich mit diesem Phänomen experimentell und es kann leicht zu einer anderen Arbeits-Modell angepasst werden, um die molekularen Mechanismen der phänotypischen Heterogenität innerhalb einer mikrobiellen Gemeinschaft aufzuklären.

Protocol

1. Labeling B. subtilis und Biofilm-Assay Amplify von PCR, das die Promotorregion des Gens von Interesse. Wir zeigen, wie beispielsweise das Klonen von P Tapa, der Promotor der Gene, die für die Herstellung von Tasa Matrixprotein 26. Klon P Tapa in pkm008 Vektor (erstellt von der Rudner Labor, Harvard Medical School. Boston, USA) (Abb. 2). Linearisieren die Plasmide durch enzymatische Verdauung (Enzyme empfohlen, XhoI). Induziere…

Discussion

Die Tatsache, dass bakterielle Gemeinschaften Subpopulationen von Zellen, die bestimmte Gruppe von Genen, beweist die Komplexität mikrobieller Gemeinschaften 33,34 zeigen. Dieses Protokoll soll helfen, festzustellen, ob die Expression eines beliebigen Gens von Interesse für eine bestimmte Subpopulation von spezialisierten Zellen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft beschränkt. Die Visualisierung dieser Subpopulationen erfordert die Entwicklung neuer Techniken, da herkömmliche Methoden Genexpression ode…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird von den Young Investigator Research Program gefördert, vom Zentrum für Infektionsforschung (zinf) von der Universität Würzburg. Juan Garcia-C Betancur ist ein Doktorand von der Graduate School of Life Sciences (GSLS) der Universität Würzburg.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar

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Cite This Article
Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).

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