Summary

وحيد الخلية تحليل الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Published: February 15, 2012
doi:

Summary

وعموما الأغشية الحيوية الميكروبية التي تشكلها مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا المتخصصة. وحيد الخلية تحليل هذه القطعان يتطلب استخدام للصحفيين فلوري. نحن هنا وصف بروتوكول لتصور ورصد عدة subpopulationswithin<em> ب. الرقيقة</em> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر مضان والتدفق الخلوي.

Abstract

تشكيل بيوفيلم هو سمة عامة للجميع تقريبا 1-6 البكتيريا. عندما البكتيريا تشكل الأغشية الحيوية، وخلايا المغطى في المصفوفة خارج الخلية التي شكلت في معظمها من البروتينات وexopolysaccharides، من بين عوامل أخرى 7-10. المغطى المجتمع الميكروبية داخل بيوفيلم يظهر في كثير من الأحيان التمييز بين subpopulation متميزة من الخلايا المتخصصة 11-17. هذه القطعان تتعايش وغالبا ما تظهر التنظيم المكاني والزماني في بيوفيلم 18-21.

تشكيل بيوفيلم في نموذج العصوية الرقيقة الحي يتطلب التفريق بين مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا المتخصصة. فيما بينها، وsubpopulation من المنتجين مصفوفة، المسؤولة عن انتاج وإفراز المصفوفة خارج الخلية من بيوفيلم أمر ضروري لتشكيل بيوفيلم 11،19. وبالتالي، التفريق بين المنتجين المصفوفة هو السمة المميزة لتشكيل بيوفيلم في B. الرقيقة.

وقد استخدمنا للصحفيين فلوري لتصور وتحديد subpopulation من المنتجين مصفوفة في الأغشية الحيوية من B. 15،19،22-24 الرقيقة. بشكل ملموس، لاحظنا أن subpopulation من المنتجين مصفوفة يفرق ردا على وجود الذات المنتجة خارج الخلية إشارة surfactin 25. ومن المثير للاهتمام، ويتم إنتاج surfactin بواسطة جزء من السكان من خلايا متخصصة تختلف عن subpopulation من المنتجين مصفوفة 15.

وقد فصلنا في هذا التقرير على نهج الفنية اللازمة لتصور وتحديد subpopulation من المنتجين والمنتجين surfactin مصفوفة داخل الأغشية الرقيقة من B.. للقيام بذلك، يتم إدراج صحفيين فلوري من الجينات اللازمة لإنتاج مصفوفة والإنتاج surfactin في كروموسوم من B. الرقيقة. يتم التعبير للصحفيين فقط في جزء من السكان من الخلايا المتخصصة. ثم، يمكن أن تكون القطعانرصدها باستخدام المجهر مضان والتدفق الخلوي (انظر الشكل 1).

حقيقة أن مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا المتخصصة التعايش داخل المجتمعات المتعددة الخلايا من البكتيريا يعطينا وجهة نظر مختلفة حول تنظيم التعبير الجيني في بدائيات النوى. هذا البروتوكول لا يتناول هذه الظاهرة بشكل تجريبي، ويمكن أن تتكيف بسهولة مع أي نموذج العمل الأخرى، لإلقاء الضوء على الآليات الجزيئية الكامنة وراء عدم التجانس المظهري داخل المجتمع الميكروبية.

Protocol

1. وضع العلامات B. الرقيقة وبيوفيلم الفحص تشكيل تضخيم من قبل الاسترداد في منطقة المروج من الجينات في المصالح. نعرض كمثال استنساخ تابا ف، المروج من الجينات المسؤولة عن إنتاج بروتين المصفوفة الطاسه 26.</s…

Discussion

حقيقة أن المجتمعات البكتيرية تظهر مجموعات سكانية فرعية من الخلايا معربا عن مجموعة محددة من الأدلة الجينات تعقيد المجتمعات الميكروبية 33،34. يجب أن هذا البروتوكول يساعد على تحديد ما إذا كان يقتصر على التعبير عن أي الجينات التي تهم جزء من السكان خاصة من خلايا متخص…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويتم تمويل هذا العمل من قبل برنامج محقق بحوث الشباب، من مركز أبحاث الأمراض المعدية (ZINF) من جامعة فورتسبورغ. C-خوان غارسيا بيتانكور، وهو زميل الدكتوراه من كلية الدراسات العليا في علوم الحياة (GSLS) من جامعة فورتسبورغ.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar

References

  1. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  2. Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).
  3. Kolenbrander, P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).
  4. O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  5. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).
  6. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Biofilms. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).
  7. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  8. Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
  9. Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. Biofilm-associated proteins. C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).
  10. O’Gara, J. P. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).
  11. Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).
  12. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).
  13. Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation. PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).
  14. Kearns, D. B., Losick, R. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).
  15. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Paracrine signaling in a bacterium. Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).
  16. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).
  17. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media. J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).
  18. Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).
  19. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
  20. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).
  21. Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  22. Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms. MBio. 1, (2010).
  23. Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
  24. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).
  25. Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).
  26. Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
  27. Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
  28. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).
  29. Yasbin, R. E., Young, F. E. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1. J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).
  30. Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
  31. Nakano, M. M. srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).
  32. Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science. 301, 510-513 (2003).
  33. Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).
  34. Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).

Play Video

Cite This Article
Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).

View Video