このレポートでは、我々は表面プラズモン共鳴は、ホストサイトゾルへ毒素のエントリを検出するために使用される方法について説明します。この高感度の方法は、細胞質毒素の量で定量的なデータを提供することができます、そしてそれは毒素の範囲に適用することができます。
ABの毒素は、酵素サブユニットと細胞結合Bサブユニット1で構成されています。これらの毒素は、細胞外環境に分泌されますが、真核生物の細胞質ゾル内のターゲットに作用している。いくつかのAB毒素の細胞表面から細胞質ゾル2-4を入力する前に、小胞体(ER)への小胞のキャリアで旅行。 ERで、毒素や動きの残りの部分から蛋白質導電性チャネルを介して触媒鎖の解離は、その細胞質ターゲット5に到達する。ほとんどの内部化毒素を分解するリソソームにルーティングされるので、表面に結合した毒素のほんの一部はゴルジ装置や小胞体6に達する:ERへの毒素の人身売買は非常に非効率的なプロセスであるため、転、細胞質ゾルのチェーンは検出が困難です。 -12。
ERからの培養細胞の細胞質ゾルへの毒素の移行を監視するには、我々はhighlと細胞下分画のプロトコルを組み合わせて表面プラズモン共鳴(SPR)13から15のy感度な検出方法。毒素処理細胞の形質膜を選択的に続いて抗毒素鎖抗体をコーティングしたSPRセンサー上灌流サイトゾル画分の収集を可能にする、ジギトニン透過化されています。抗体でコーティングされたセンサーは、細胞質毒素のpg / mLの量をキャプチャし、検出することができます。このプロトコルで、それは細胞質ゾルへの毒素のエントリの動態を追跡すると、転座のイベントの抑制効果を評価することも可能です。細胞質毒素の濃度は、センサを介して灌流されているチェーンの規格の既知の量で生成された標準曲線から計算することができます。私たちの方法は、放射性標識またはターゲットの毒素に他の変更を必要としない迅速、高感度、および定量的な検出システムを表します。
既存の手法との比較
私たちのSPRベースの相互転座試験では、ホストの細胞質ゾル中に毒素の配信を検出するための迅速、高感度、および定量的なメソッドを表します。手法は、毒素に放射性標識または他の変更を必要としない、それは抗毒素鎖抗体が利用できる任意の毒素に適用することができます。細胞質ゾルへの毒素の通過を監視するために既存の方法はまた別の細?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、K. TeterにNIHの助成R01 AI073783によって賄われていた。私たちは、原稿の重要な読書のための細胞下分画プロトコルとヘレンBurressの開発の支援のために博士シェーンマッシーに感謝。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Digitonin | Sigma | D141 |
Ethanol | Acros | 61509-0010 |
DMEM | Invitrogen | 11995065 |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
Ganglioside GM1 | Sigma | G7641 |
CTA | Sigma | C2398 |
PTS1 | List | 182 |
NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce | 24500 |
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Scientific | 22981 |
Ethanolamine | Sigma | E0135 |
PBST | Medicago | 09-8903-100 |
Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotech | sc-80747 |
Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 |
Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-57639 |
Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC |
SPR sensor slides | Reichert | 13206060 |
Syringe pump | Cole Palmer | 780200C |