בדו"ח זה, אנו מתארים כיצד plasmon משטח תהודה משמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך cytosol המארח. שיטה זו רגישה מאוד יכול לספק נתונים כמותיים על כמות הרעלן cytosolic, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלים.
רעלים AB מורכב האנזימטית למקטע ו למקטע תא מחייב B 1. רעלנים אלה מופרשים אל הסביבה תאיים, אבל הם פועלים על מטרות בתוך cytosol האיקריוטים. יש רעלים א.ב. לנסוע נושאות שלפוחית מפני השטח של התא אל reticulum endoplasmic (ER) לפני הכניסה cytosol 2-4. ב ER, קטליטי שרשרת מנתק משאר הרעלן ועובר דרך ערוץ חלבון מנהלת להגיע ליעד cytosolic שלה 5. Translocated, cytosolic שרשרת קשה לזהות כי סחר רעלן לחדר המיון הוא תהליך יעיל ביותר: רעלן הפנימו ביותר מנותבת אל lysosomes של השפלה, ולכן רק חלק קטן של רעלן פני הנכנס מגיע מנגנון Golgi ו – ER 6 -12.
כדי לפקח על טרנסלוקציה רעלן מ ER כדי cytosol של תאים בתרבית, ששילבנו פרוטוקול חלוקה subcellular עם highly שיטה לגילוי רגיש של plasmon משטח תהודה (SPR) 13-15. קרום הפלזמה של תאים שטופלו הוא רעלן permeabilized סלקטיבי עם digitonin, המאפשר איסוף של שבריר cytosolic אשר perfused לאחר מכן על החיישן SPR מצופה רעלן אנטי נוגדנים שרשרת. החיישן נוגדן מצופה יכולים ללכוד לזהות pg / mL כמויות של רעלן cytosolic. באמצעות פרוטוקול זה, אפשר לעקוב אחר קינטיקה של כניסה רעלן לתוך cytosol ו לאפיין תופעות מעכבות על האירוע טרנסלוקציה. ריכוז של טוקסין cytosolic ניתן גם לחשב עקומת סטנדרט שנוצר עם כמויות ידוע של סטנדרטים בשרשרת כי כבר perfused על החיישן. השיטה שלנו מייצג מערכת מהירה, זיהוי רגיש, כמותי שאינו מחייב radiolabeling או שינויים אחרים רעלן היעד.
השוואה המתודולוגיה הקיימת
Assay SPR מבוססי שלנו טרנסלוקציה מייצג שיטה מהירה, רגיש, כמותי כדי לזהות משלוח רעלן לתוך cytosol המארח. הטכניקה אינה דורשת radiolabeling או שינויים אחרים הרעלן, וזה יכול להיות מיושם על כל רעלן עבורו אנטי רעלן נוגדנים ש?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R01 AI073783 כדי Teter ק. אנו מודים לד"ר שיין מאסי לסיוע בפיתוח של חלוקה פרוטוקול subcellular והלן Burress לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Digitonin | Sigma | D141 |
Ethanol | Acros | 61509-0010 |
DMEM | Invitrogen | 11995065 |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
Ganglioside GM1 | Sigma | G7641 |
CTA | Sigma | C2398 |
PTS1 | List | 182 |
NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce | 24500 |
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Scientific | 22981 |
Ethanolamine | Sigma | E0135 |
PBST | Medicago | 09-8903-100 |
Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotech | sc-80747 |
Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 |
Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-57639 |
Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC |
SPR sensor slides | Reichert | 13206060 |
Syringe pump | Cole Palmer | 780200C |