In dit rapport beschrijven we hoe oppervlakte plasmon resonantie wordt gebruikt om toegang toxine te detecteren in de gastheer cytosol. Deze zeer gevoelige methode kan kwantitatieve gegevens over de hoogte van cytosolische toxine, en het kan worden toegepast op een reeks van toxines.
AB toxines bestaan uit een enzymatische A subeenheid en een cel-bindend B-subunit 1. Deze toxinen worden uitgescheiden in de extracellulaire milieu, maar ze reageren op doelen binnen de eukaryote cytosol. Sommige AB toxines reizen blaasje luchtvaartmaatschappijen uit het celoppervlak naar het endoplasmatisch reticulum (ER), voordat u het cytosol 2-4. In de ER, om de katalytische A-keten distantieert van de rest van de toxine en beweegt zich door een eiwit-geleidende kanaal bereiken zijn cytosolische doel 5. De getransloceerde, cytosolische Een ketting is moeilijk op te sporen omdat toxine mensenhandel aan de ER is een zeer inefficiënt proces: de meeste geïnternaliseerd toxine is doorgestuurd naar de lysosomen voor degradatie, zodat slechts een kleine fractie van het oppervlak gebonden toxine bereikt het Golgi-apparaat en ER 6 -12.
Voor het bewaken van toxine translocatie uit het ER naar het cytosol in gekweekte cellen, combineerden we een subcellulaire fractionering protocol met de highly gevoelige detectiemethode van surface plasmon resonance (SPR) 13-15. Het plasmamembraan van de toxine-behandelde cellen selectief gepermeabiliseerd met digitonine, waardoor verzameling van een cytosolische fractie die vervolgens wordt doorbloed meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-toxine A-keten antilichaam. Het antilichaam-gecoate sensor kan vangen en op te sporen pg / mL hoeveelheden cytosolisch toxine. Met dit protocol, is het mogelijk om de kinetiek van de toxine toegang te volgen in het cytosol en remmende effecten op de translocatie evenement karakteriseren. De concentratie van cytosolisch toxine kan ook worden berekend op basis van een standaard curve gegenereerd met bekende hoeveelheden van een keten normen die zijn doorbloed over de sensor. Onze methode is een snelle, gevoelige en kwantitatieve detectie systeem dat niet nodig radiolabeling of andere wijzigingen van het doel toxine.
Vergelijking met bestaande methodologie
Onze SPR-gebaseerde translocatie assay is een snelle, gevoelige en kwantitatieve methode om de levering toxine te detecteren in de gastheer cytosol. De techniek vereist geen radiolabeling of andere wijzigingen van het toxine, en het kan worden toegepast op elk toxine waarvoor een anti-toxine A keten antilichaam beschikbaar is. Bestaande methoden voor het toxine passage monitor in het cytosol ook vertrouwen op een subcellulaire fractionatie protocol te pa…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie R01 AI073783 naar K. Teter. Wij danken dr. Shane Massey voor hulp bij de ontwikkeling van de subcellulaire fractionatie protocol en Helen Burress voor de kritische lezing van het manuscript.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Digitonin | Sigma | D141 |
Ethanol | Acros | 61509-0010 |
DMEM | Invitrogen | 11995065 |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
Ganglioside GM1 | Sigma | G7641 |
CTA | Sigma | C2398 |
PTS1 | List | 182 |
NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce | 24500 |
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Scientific | 22981 |
Ethanolamine | Sigma | E0135 |
PBST | Medicago | 09-8903-100 |
Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotech | sc-80747 |
Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 |
Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-57639 |
Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC |
SPR sensor slides | Reichert | 13206060 |
Syringe pump | Cole Palmer | 780200C |