DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo
Summary
Le proiezioni stereotipata di afferenze sensoriali nel midollo spinale di roditori offrire un sistema facilmente accessibile sperimentale per studiare ramificazione degli assoni attraverso il tracciamento degli assoni singolo.
Abstract
Qui vi presentiamo una tecnica per etichettare le traiettorie di piccoli gruppi di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale dalla colorazione diffusivo utilizzando il tracciante lipofilo 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . Il confronto di percorsi assonale di wild-type con quelli di topi in cui sono mutati i geni consente di testare per un ruolo funzionale delle proteine candidato nel controllo della ramificazione degli assoni che è un meccanismo essenziale per il cablaggio del sistema nervoso. Assonale ramificazione permette ad un singolo neurone per connettersi con bersagli multipli, fornendo così le basi fisiche per l'elaborazione parallela di informazioni. Ramificazioni in regioni obiettivo intermedio di crescita assonale può essere distinto da arborizzazione terminale. Inoltre, diverse modalità di formazione ramo assonale possono essere classificati a seconda che i risultati ramificazione delle attività del cono di crescita (splitting o reggiseno in ritardonching) o lo sbocciare di collaterali dal pozzo assone in un processo chiamato interstiziale ramificazione 2 (Fig. 1).
Le proiezioni centrali dei neuroni dal DRG offrire un utile sistema sperimentale per studiare entrambi i tipi di ramificazione assonale: quando i loro assoni afferenti raggiungere la dorsale zona di ingresso principale (DREZ) del midollo spinale embrionale tra i giorni 10-13 (E10 – E13) che visualizzare un modello stereotipato di T-o Y biforcazione. I due assoni figlia risultante quindi procedere in direzione rostrale o caudale, rispettivamente, al margine dorsolaterale del midollo e solo dopo un periodo di attesa collaterali germogliano da queste assoni staminali di penetrare la materia grigia (interstiziale ramificazione) e il progetto di neuroni in specifiche relè lamine del midollo spinale, dove ulteriori arborize (ramificazione terminale) 3. Tracciati DII hanno rivelato coni di crescita nella zona dorsale voce principale del midollo spinale che sembrava essere in process della scissione suggerendo che biforcazione è causata dalla scissione del cono di crescita in sé 4 (Fig. 2), tuttavia, altre opzioni sono state discusse anche 5.
Questo video dimostra come prima di sezionare il midollo spinale dei topi E12.5 lasciare il DRG allegato. A seguito di fissazione degli importi piccolo campione di DII vengono applicati a DRG con aghi di vetro tirato da tubi capillari. Dopo una fase di incubazione, il midollo spinale è montato etichettato come un libro aperto rovesciato preparazione di analizzare i singoli assoni usando la microscopia a fluorescenza.
Protocol
Discussion
Modelli stereotipati di proiezione che comprende entrambi i tipi di formazione ramo assonale insieme a facilità di preparazione, in combinazione con l'uso di tessuto fissato per Dii etichette rende il midollo spinale embrionale con allegato un modello DRG favorevole per lo studio assonale ramificazione. L'applicazione di piccole quantità di Dii con aghi di vetro rivestito permette – in contrasto con l'etichettatura maggior parte dei DRG – la visualizzazione di piccoli gruppi di neuroni DRG e quindi l'a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center di Berlino) per gli utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal centro di ricerca collaborativa (SFB665) del Consiglio di ricerca tedesco (DFG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Zeiss | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl–indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O’Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
