Summary

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Published: December 13, 2011
doi:

Summary

Die stereotypen Projektionen von sensorischen Afferenzen in das Nagetier Rückenmark bieten eine leicht zugängliche experimentelle System zur axonalen Verzweigung durch die Verfolgung einzelner Axone zu studieren.

Abstract

Hier präsentieren wir eine Technik, um die Flugbahnen der kleinen Gruppen von DRG-Neuronen in den embryonalen Rückenmark Label diffusive Färbung unter Verwendung des lipophilen Tracer 1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI) 1 . Der Vergleich der axonalen Bahnen von Wildtyp-mit denen der Maus Zeilen, in denen Gene mutiert sind erlaubt die Prüfung für eine funktionale Rolle der Kandidaten-Proteine ​​in der Kontrolle des axonalen Verzweigungen, die ein wesentlicher Mechanismus in der Verdrahtung des Nervensystems ist. Axonal Verzweigung ermöglicht ein einzelnes Neuron mit mehreren Zielen verbinden, wodurch die physikalische Grundlage für die parallele Verarbeitung von Informationen. Ramifications bei mittleren Zielregionen des axonalen Wachstums kann von Endverzweigung unterschieden werden. Darüber hinaus kann in verschiedenen Modi axonale Verzweigung Bildung abhängig davon, ob Verzweigung ergibt sich aus der Tätigkeit des Wachstums Kegel (Splitting oder verzögert BH klassifiziert werdennching) oder aus den Knospen von Sicherheiten aus dem Axon Welle in einem Prozess namens interstitielle Verzweigung 2 (Abb. 1).

Die zentralen Projektionen von Neuronen aus dem DRG bieten ein nützliches experimentelles System, um beide Arten von axonalen Verzweigung Studie: wenn ihre afferenten Axone erreichen die Spinalganglien entry zone (Drez) des Rückenmarks zwischen embryonalen Tage 10 bis 13 (E10 – E13) sie Anzeige einer stereotypen Muster von T-oder Y-förmigen Verzweigung. Die beiden entstehenden Tochterzellen Axone dann in rostralen oder kaudalen Richtungen gehen jeweils an der dorsolateralen Rand der Schnur und erst nach einer Wartezeit Sicherheiten sprießen aus diesen Stammzellen Axone in die graue Substanz (interstitielle Verzweigung) und Projekt-Relais Nervenzellen in bestimmten eindringen Laminae des Rückenmarks, wo sie weiter verzweigen (Klemme Verzweigung) 3. DiI Kurven haben das Wachstum Kegel an der Spinalganglien Eingangszone des Rückenmarks, die in der pr sein schien enthülltocess der Aufspaltung darauf hindeutet, dass Bifurkation durch die Spaltung des Wachstums Konus selbst 4 (Abb. 2) verursacht wird, jedoch auch andere Optionen, wie gut 5 diskutiert worden.

Dieses Video zeigt zunächst, wie man das Rückenmark von E12.5 Mäusen Verlassen des DRG befestigt sezieren. Nach der Fixierung des Prüflings winzige Mengen DiI angewendet werden, um DRG mit Glas Nadeln aus Kapillaren gezogen. Nach einer Inkubationszeit Schritt wird der markierte Rückenmark als ein umgekehrtes Open-Book Vorbereitung auf einzelne Axone mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert montiert.

Protocol

1. Dissection Verfahren Hinweis: Experimentelle Verwendung von Mäusen sollten amtlich zugelassen folgen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren. Vor der Präparation, richten Sie Ihren Präpariermikroskop und legen die chirurgischen Instrumente für die Präparation, darunter grosse und kleine Schere, große Zahn-Zange, einer gebogenen Pinzette und vier Gruppen von Dumont No.5 Pinzette (von denen zwei inside-polierte Spitzen haben) notwendig ( für Detail…

Discussion

Stereotype Projektionsmuster aus beiden Arten von axonalen Verzweigung Bildung zusammen mit einfachen Herstellung in Kombination mit der Verwendung von fixiertem Gewebe für DiI Kennzeichnung macht die embryonalen Rückenmarks mit angeschlossenem DRG ein günstiges Modell zu studieren axonale Verzweigung. Die Anwendung von kleinsten Mengen an DiI mit beschichtetem Glas Nadeln ermöglicht – im Gegensatz zu den Bulk-Kennzeichnung von DRG – die Visualisierung von kleinen Gruppen von DRG-Neuronen und damit die Analyse einze…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Alistair Garratt (Max-Delbrück-Centrum, Berlin) für hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde von der SFB (SFB665) von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Stereomicroscope Stemi DRC Zeiss    
Phosphate-buffered solution (PBS) Biochrom AG L182-50  
Paraformaldehyde Merck 8.18715.1000  
Standard surgical scissors Fine Science Tools 14001-13  
Toothed standard forceps Fine Science Tools 11021-14  
Extra fine iris scissors Fine Science Tools 14088-10  
Curved forceps Fine Science Tools 11003-13  
Dumont No.5 fine tips forceps Fine Science Tools 11254-20  
Dumont No.5 mirror finish forceps Fine Science Tools 11252-23  
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08  
Filter paper Fisher Scientific FB59041  
Sylgard 184 World Precission Instruments SYLG184  
100-mm Petri dishes Greiner 663102  
12-ml polypropylene tube Carl Roth GmbH ECO3.1  
12-well culture plate Becton Dickinson 35-3043  
Ethanol Merck 1.00983.2500  
Flaming/Brown micropipette puller P-97 Sutter Instrument Co.    
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0066  
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Sigma-Aldrich 468495  
Microscope slides SuperFrost Plus Carl Roth GmbH H867.1  
Glass cover slips Carl Roth GmbH 1870.2  

References

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Cite This Article
Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord. J. Vis. Exp. (58), e3667, doi:10.3791/3667 (2011).

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