DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר
Summary
תחזיות סטריאוטיפית של afferents חושי אל חוט השדרה מכרסם להציע מערכת ניסיונית נגיש ללמוד axonal מסתעפת דרך התחקות של אקסונים יחיד.
Abstract
כאן אנו מציגים טכניקה התווית מסלולים של קבוצות קטנות של נוירונים DRG לתוך חוט השדרה העובר על ידי מכתים diffusive באמצעות נותב lipophilic 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI) פרכלורט 1 . ההשוואה בין המסלולים axonal של wild-type עם אלה של קווי העכבר אילו גנים שעברו מוטציה המאפשרת בדיקת תפקיד פונקציונלי של חלבונים מועמד בשליטה על הסתעפות axonal המהווה מנגנון חיוני החיווט של מערכת העצבים. הסתעפות axonal מאפשר נוירון יחיד להתחבר עם מטרות מרובות, ובכך לספק את הבסיס הפיזי של עיבוד מקבילי של מידע. השלכות על אזורים יעד ביניים של צמיחה axonal ניתן להבחין בין arborization סופנית. יתר על כן, מצבים שונים של היווצרות ענף axonal ניתן לסווג תלוי אם תוצאות מסתעפת מן הפעילויות של חרוט צמיחה (פיצול או חזייה מתעכבnching) או מפני נביטה של בטחונות מן הפיר האקסון בתהליך הנקרא הסתעפות ביניים 2 (איור 1).
תחזיות המרכזית של נוירונים של DRG להציע מערכת ניסיונית שימושי ללמוד את שני הסוגים של הסתעפות axonal: כאשר האקסונים שלהם מביא להגיע השורש הגבי כניסה לאזור (דח) של חוט השדרה העובר בין ימים 10-13 (E10 – E13) הם התצוגה דפוס סטריאוטיפי של T-Y או בצורת הסתעפות. שני אקסונים הבת וכתוצאה מכן להמשיך בכיוונים מקורי או הזנב, בהתאמה, בשוליים דורסולטרלי של חוט ורק לאחר תקופת המתנה בטחונות צומחים מתוך גזע אקסונים אלה לחדור את החומר האפור (ביניים הסתעפות) ואת פרויקט ספציפי של נוירונים ממסר רבדים של חוט השדרה שם הם עוד arborize (מסוף הסתעפות) 3. העתקים DiI חשפו קונוסים צמיחה בכל אזור הכניסה השורש הגבי של חוט השדרה זה נראה ב-PRocess של פיצול טוען כי הסתעפות נגרמת על ידי פיצול של חרוט הצמיחה עצמה 4 (איור 2), עם זאת, אפשרויות אחרות נדונו גם 5.
וידאו זה מדגים הראשונה איך לנתח את עמוד השדרה של עכברים E12.5 עוזב DRG המצורפת. קיבעון בעקבות הסכומים דגימה קטנה של DiI מוחלים DRG באמצעות מחטים זכוכית משך משפופרות נימי. לאחר שלב דגירה, חוט השדרה שכותרתו מותקן כהכנה פתוח ספר הפוך לנתח אקסונים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Protocol
Discussion
דפוסי הקרנת סטריאוטיפית הכוללת את שני הסוגים של היווצרות ענף axonal יחד עם קלות הכנה בשילוב עם שימוש ברקמת קבוע DiI תיוג הופך את חוט השדרה העובר צמוד עם DRG מודל חיובי ללמוד axonal הסתעפות. היישום של כמויות זעירות של DiI באמצעות מחטים זכוכית מצופה מאפשר – בניגוד תיוג עיקר DRG – להד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר אליסטר Garratt (מקס Delbrück מרכז ברלין) על הערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מחקר שיתופי (SFB665) של מועצת המחקר הגרמנית (DFG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Zeiss | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl–indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O’Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
