Summary

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Published: July 26, 2012
doi:

Summary

Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.

Abstract

Los cultivos primarios de rata y las neuronas del hipocampo de ratón se utilizan ampliamente para revelar los mecanismos celulares en neurobiología. Al aislar y cultivar las neuronas individuales, los investigadores son capaces de analizar las propiedades relacionadas con el tráfico celular, estructura celular y la localización de la proteína individual, utilizando una variedad de técnicas bioquímicas. Los resultados de estos experimentos son críticos para probar las teorías que abordan las bases neurales de la memoria y el aprendizaje. Sin embargo, los resultados inequívocos de estas formas de experimentos se basan en la capacidad de crecer cultivos neuronales con mínima contaminación por otros tipos de células cerebrales. En este protocolo, el uso de los medios de comunicación específicos diseñados para el crecimiento de neuronas y la cuidadosa disección de tejido del hipocampo embrionario para optimizar el crecimiento de las neuronas sanas y reducir al mínimo los tipos de células contaminantes (es decir, los astrocitos). Embrionario tejido del hipocampo de ratón puede ser más difícil de aislar de tejido roedor similar debido al tamaño de la muestra para dissection. Se muestran las técnicas de disección detallada de hipocampo de embriones crías de ratón del día 19 (E19). Una vez que el tejido del hipocampo es aislado, la disociación suave de las células neuronales se logra con una concentración diluida de la tripsina y la disrupción mecánica diseñado para separar las células de tejido conectivo mientras que proporciona el mínimo daño a las células individuales. Una descripción detallada de cómo preparar pipetas para ser utilizado en la interrupción está incluido. Densidades óptimas de planchas se proporcionan para los inmuno-fluorescencia protocolos para maximizar el cultivo de células de éxito. El protocolo proporciona una técnica rápida (aproximadamente 2 horas) y eficiente para el cultivo de células neuronales a partir de tejido del hipocampo del ratón.

Protocol

1. Puesta en marcha antes de la cosecha Para generar crías prenatales para la cosecha de las neuronas, programar la reproducción entre los ratones adultos 19 días antes del día de aislamiento neurona. (Ratones C57BL / 6 años de edad de 2-8 meses se utilizaron en los apareamientos para los propósitos de desarrollo de este protocolo). El éxito de apareamiento puede ser confirmado por la detección de un tapón vaginal en la confirmación de las mujeres, palpitaciones o visual del embarazo. …

Discussion

Cultivos de hipocampo se han utilizado en la biología molecular de más de 20 años. Aunque, en principio, cultivos neuronales se pueden hacer de cualquier parte del cerebro, cultivos de hipocampo han demostrado ser el más popular debido a la arquitectura relativamente simple de la población de células nerviosas en el hipocampo 7. Cultivos de hipocampo son típicamente hechos de la última etapa del tejido embrionario. Este tejido es más fácil para disociar y contiene menos células gliales que funciona…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Michael Wooten por su ayuda en la preparación del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIH 2RO1NS033661 (MWW).

Materials

Name of Reagent Vendor Catalog Number
Rat Tail Collagen 1 BD Biosciences 354236
Poly-D-lysine Solution Chemicon A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution Invitrogen 14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid Invitrogen 15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid Invitrogen 21103-049
B27 Supplement (50X) liquid Invitrogen 17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid Invitrogen 25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) Invitrogen 15140-148
HI-Donor Horse Serum Atlanta Biologicals S12150H

References

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
  2. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
  3. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
  4. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
  5. Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
  6. Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
  7. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  8. Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
  9. Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
  10. Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
  11. Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
  12. Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
  13. Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
  14. Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).

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Cite This Article
Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. J. Vis. Exp. (65), e3634, doi:10.3791/3634 (2012).

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