Summary

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Published: May 07, 2012
doi:

Summary

Burada ilk iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu göbek kordon kanı, ağırlıklı naif T hücrelerinin kaynağı virüs-spesifik sitotoksik T lenfositler (CTL) üretme yöntemi açıklar.

Abstract

Kök hücre nakli sonrası Virüs enfeksiyonları, özellikle kordon kanı sonra, ölümün en sık nedenleri arasındadır (CB) transplantasyonu (TCMB) burada CB enfeksiyondan alıcı koruyabilirsiniz virüs deneyimli T hücreleri 1 sezilebilir numaraları içermez. Biz ve diğerleri, virüs spesifik CTL seropozitif vericilerden elde edilen ve alıcı için infüze olduğunu göstermiştir 4 güvenli ve koruyucu. 5-8 Bununla birlikte, yakın zamana kadar, virüs spesifik T hücreleri dolayı muhtemelen, kordon kan elde edilememiştir virüs özel bellek T hücrelerinin yokluğunda.

Daha naif T hücrelerinin in vivo emişli koşullarda taklit çabasıyla, biz böylece T hücre spesifitesi sürüş, CB-türevli dendritik hücreler (DC) immünodominant CMV antijeni pp65 içeren bir adenoviral vektör (Ad5f35pp65) ile transdük kullanılan bir yöntem kurdu inisiyasyon az CMV ve adenovirüs. 9 doğru, biz bu ma kullanınyakalandığı DC'ler gibi her ikisi de ifade IL-7, IL-12 ve IL-15. ikinci biz EBV-dönüştürülmüş B hücreleri uyarımı kullanılmış, ya da EBV-LCL, az 10 sitokinler varlığında CB-alınan T-hücrelerinde latent ve litik EBV antijenleri. Ad5f35pp65-transdük EBV-LCL ikinci stimülasyon da IL-15 varlığında T hücrelerinin uyarmak için kullanılır. Müteakip uyarımlar EBV-LCL ve IL-2 Ad5f35pp65-transduced kullanın.

50×10 6 CB mononükleer hücreler itibaren biz antijenik uyarılara yanıt olarak antijen ile doldurulan hedefleri ve serbest sitokinler lyse 150 x 10 6 virüs-spesifik T hücreleri yukarı oluşturmak edebiliyoruz. 11. Bu hücreler kullanılarak GMP uyumlu şekilde imal edilmiştir yalnızca % 20 bir fraksiyone kordon kanı ünitesi fraksiyonu ve klinik kullanım için tercüme edilmiştir.

Protocol

1. Mononükleer Hücre İzolasyonu (gün 0) Kordon kanı ünitesi% 20 fraksiyonu çıkış portuna dişi luer adaptör başak takın, şırınga takın ve kan çıkarın. 50 ml santrifüj tüpüne ısıtılmış RPMI içinde 20 mL çözülmüş kan aktarın. RPMI 5 mL kordon kan torbası Durulama ve aynı santrifüj tüpüne aktarılır. 400 x g hızında 10 dakika için hücreler santrifüjleyin. Süpernatant aspire. Sıcak RPMI 20 mL hücreler yeniden süspanse edin. 50 mL santrifüj tü…

Discussion

TCMB sonra viral enfeksiyonlar kontrol altına almayı amaçlayan güncel yaklaşımlar etkili olabilir, ancak önemli toksisiteleri ile ilişkili, pahalıdır ve daha sonra enfeksiyona karşı uzun süreli koruma kazandırmaz. Aslında, bazı antiviral ilaçların kullanımı başka koruyucu olacağı virüs-spesifik T hücrelerin genişlemesini sınırlayan olabilir. 14. Başka bir seçenek donör kaynaklı virüs özel T-hücrelerinin bir infüzyon. Biz ve diğerleri gibi T hücreleri İşte, güvenl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Dan L. Duncan işbirlikçi araştırma bursu (SPK ve EJS), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (US4HL081007), bir Lösemi ve Lenfoma Derneği Klinik Araştırmacı Ödülü (SPK) ve Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen (RO1 CA06150816; EJS).

Materials

Name of reagent Company Catalogue number
RPMI 1640 Invitrogen 21870-076
DC media CellGenix 20801-0500
EHAA (Click’s Medium) Irvine Scientific 9195
Human Serum Gemini Bio Products 100-110
Gas Permeable Cultureware18 Wilson-Wolf 80040S
IL-2 Chiron (TCH Pharmacy)  
IL-12 NCI/CTEP  
IL-15 CellGenix 1013-050
IL-7 R&D AFL207
IL-1beta R&D AFL201
IL-6 CellGenix 1004-050
GM-CSF TCH Pharmacy  
IL-4 R&D AFL204
TNF-alpha R&D AFL210
Ad5f35pp65 BCM CAGT Vector Production Facility  
Plasma transfer set with female luer adapter Charter Medical 89-550-66j
Lymphoprep Nycomed 1114550

References

  1. Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
  2. Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
  3. Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
  4. Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
  5. Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
  6. Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
  7. O’Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
  8. Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
  9. Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
  10. Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
  11. Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
  12. Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
  13. Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
  14. Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
  15. Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
  16. Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
  17. Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S39-S45 (2011).
  18. Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).

Play Video

Cite This Article
Hanley, P. J., Lam, S., Shpall, E. J., Bollard, C. M. Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus. J. Vis. Exp. (63), e3627, doi:10.3791/3627 (2012).

View Video