Summary

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Published: May 07, 2012
doi:

Summary

Hier beschreiben wir die erste Good Manufacturing Practice (GMP)-kompatiblen Verfahren zur Herstellung virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) aus Nabelschnurblut, eine Quelle von überwiegend naiven T-Zellen.

Abstract

Virus-Infektionen nach einer Stammzelltransplantation gehören zu den häufigsten Todesursachen, besonders nach Nabelschnurblut (CB) Transplantation (CBT), wo die CB enthält keine nennenswerte Zahl von Virus-erfahrenen T-Zellen, die den Empfänger vor einer Infektion schützen können 1. – Wir und andere 4 gezeigt, dass Virus-spezifische CTL von seropositiven Spendern erzeugt und an den Empfänger infundiert haben sind sicher und schützend. 5-8 jedoch bis vor kurzem Virus-spezifischen T-Zellen nicht aus Nabelschnurblut erzeugt werden, was wahrscheinlich auf die Abwesenheit von virus-spezifischen Gedächtnis-T-Zellen.

In dem Bemühen, besser zu imitieren die in vivo Bedingungen Priming von naiven T-Zellen haben wir ein Verfahren, CB-abgeleitete dendritische Zellen (DC) transduziert mit einem adenoviralen Vektor (Ad5f35pp65), enthaltend die CMV immundominanten pp65 verwendet, daher T-Zell-Spezifität Antreiben Richtung CMV und Adenovirus. 9 Bei der Initiierung, verwenden wir diese marierte DCs sowie CB-abgeleiteten T-Zellen in Gegenwart der Cytokine IL-7, IL-12 und IL-15. 10 In der zweiten Stimulation verwendeten wir EBV-transformierten B-Zellen oder EBV-LCL, die sowohl exprimieren latente und lytische EBV-Antigene. Ad5f35pp65-transduzierten EBV-LCL werden verwendet, um die T-Zellen in Gegenwart von IL-15 bei der zweiten Stimulation zu stimulieren. Nachfolgende Reize verwenden Ad5f35pp65-transduzierten EBV-LCL und IL-2.

Von 50×10 6 CB mononukleären Zellen können wir nach oben von 150 x 10 6 Virus-spezifischen T-Zellen, Antigen-gepulste Freisetzung Targets und Zytokinen in Reaktion auf Antigenstimulation lysieren erzeugen. 11. Diese Zellen wurden in einer GMP-gerechte Weise hergestellt unter Verwendung nur die 20%-Anteil an einer fraktionierten Nabelschnurblut Einheit und haben für den klinischen Einsatz übersetzt worden.

Protocol

Ein. Mononukleären Zellen Isolation (Tag 0) Legen Spitze von weiblichen Luer-Adapter in die Steckdose Port des 20% Anteil an der Nabelschnurblut-Einheit legen Spritze und entfernen Sie das Blut. Die aufgetauten Blut 20 ml RPMI erwärmt in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Spülen Nabelschnurblut Beutel mit 5 ml RPMI und Transfer zum gleichen Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge Zellen für 10 Minuten bei 400 x g beträgt. Absaugen des Überstandes. Resuspendieren Zellen in 20 ml warmem RPMI. Schich…

Discussion

Aktuelle Strategien zur Steuerung virale Infektionen nach CBT soll wirksam sein kann, aber sie sind mit erheblicher Toxizität verbunden sind, sind teuer und nicht verleihen langfristigen Schutz gegen spätere Infektionen. In der Tat kann die Verwendung einiger antiviralen Medikamenten begrenzen die Expansion des Virus-spezifischen T-Zellen, die sonst Schutzschicht. 14 weitere Option ist die Infusion von Donor-derived Virus-spezifischen T-Zellen. Wir und andere haben gezeigt, dass solche T-Zellen sicher…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Dan L. Duncan kollaborative Forschungsstipendium (CMB und EJS), der National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), ein Leukemia and Lymphoma Society Clinical Research Scholar Award (CMB), und dem National Cancer Institute unterstützt (RO1 CA06150816; EJS).

Materials

Name of reagent Company Catalogue number
RPMI 1640 Invitrogen 21870-076
DC media CellGenix 20801-0500
EHAA (Click’s Medium) Irvine Scientific 9195
Human Serum Gemini Bio Products 100-110
Gas Permeable Cultureware18 Wilson-Wolf 80040S
IL-2 Chiron (TCH Pharmacy)  
IL-12 NCI/CTEP  
IL-15 CellGenix 1013-050
IL-7 R&D AFL207
IL-1beta R&D AFL201
IL-6 CellGenix 1004-050
GM-CSF TCH Pharmacy  
IL-4 R&D AFL204
TNF-alpha R&D AFL210
Ad5f35pp65 BCM CAGT Vector Production Facility  
Plasma transfer set with female luer adapter Charter Medical 89-550-66j
Lymphoprep Nycomed 1114550

References

  1. Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
  2. Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
  3. Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
  4. Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
  5. Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
  6. Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
  7. O’Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
  8. Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
  9. Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
  10. Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
  11. Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
  12. Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
  13. Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
  14. Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
  15. Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
  16. Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
  17. Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S39-S45 (2011).
  18. Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).

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Cite This Article
Hanley, P. J., Lam, S., Shpall, E. J., Bollard, C. M. Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus. J. Vis. Exp. (63), e3627, doi:10.3791/3627 (2012).

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