Summary

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Published: May 07, 2012
doi:

Summary

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Abstract

Virus infecties na stamceltransplantatie behoren tot de meest voorkomende oorzaken van sterfte, vooral na navelstrengbloed (CB) transplantatie (CBT), waar de CB bevat geen aanzienlijke aantallen van virus-ervaren T-cellen die de ontvanger kan beschermen tegen infectie 1. – 4 Wij en anderen hebben aangetoond dat virus-specifieke CTL gegenereerd uit seropositieve donoren en toegediend aan de ontvanger veilig en beschermend. 5-8 Tot voor kort, virus-specifieke T-cellen niet kunnen worden gegenereerd uit navelstrengbloed, waarschijnlijk door de Aangezien virus-specifieke geheugen T-cellen.

In een poging om beter na te bootsen in vivo priming omstandigheden van naïeve T-cellen hebben we een methode die gebruikt CB-afgeleide dendritische cellen (DC) getransduceerd met een adenovirale vector (Ad5f35pp65) met de immunodominante CMV pp65 antigen dus een T celspecificiteit in de richting van CMV en adenovirus. 9 Bij initiatie, gebruiken we deze mareerde DCs als CB-afgeleide T-cellen in aanwezigheid van de cytokinen IL-7, IL-12 en IL-15. 10 Op de tweede stimulatie we EBV-getransformeerde B-cellen of EBV-LCL, die zowel uitdrukken latente en lytische EBV-antigenen. Ad5f35pp65-getransduceerde EBV-LCL worden gebruikt om de T cellen te stimuleren in aanwezigheid van IL-15 bij de tweede stimulatie. Volgende stimulaties gebruik Ad5f35pp65 getransduceerde EBV-LCL en IL-2.

Van 50×10 6 CB mononucleaire cellen kunnen wij ruim 150 x 10 6 virus-specifieke T-cellen die antigen-gepulseerde doelen en afgifte cytokines lyseren in reactie op antigene stimulatie genereren. 11 Deze cellen werden in een GMP-compatibele wijze met alleen de 20% fractie van een gefractioneerde navelstrengbloed en zijn vertaald voor klinisch gebruik.

Protocol

1. Mononucleaire cellen Isolatie (dag 0) Plaats spike van vrouwelijke luer adapter in uitlaatpoort van de 20% fractie van de navelstrengbloed, sluit spuit en verwijder bloed. Overdracht ontdooid bloed 20 ml verwarmd RPMI in 50 ml centrifugebuis. Spoel navelstrengbloed zakje met 5 ml RPMI en transfer naar dezelfde centrifugebuis. Centrifugeer cellen gedurende 10 minuten bij 400 x g. Aspireren supernatant. Resuspendeer cellen in 20 ml warm RPMI. Laag cellen op 15 ml Lymphoprep in 50 ml centr…

Discussion

Huidige strategieën gericht op de beheersing virale infecties na CBT kan effectief zijn, maar ze geassocieerd met significante toxiciteit, zijn duur en niet verlenen langdurende bescherming tegen infectie later. In feite kan het gebruik van een aantal antivirale middelen beperkt de groei van virus-specifieke T-cellen die anders beschermende 14. Een andere mogelijkheid is de infusie van donor afgeleide virus-specifieke T cellen. Wij en anderen hebben aangetoond dat T cellen Hier veilige, effectieve en r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een Dan L. Duncan collaboratief onderzoek subsidie ​​(CMB en EJS), het National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), een leukemie en lymfoom Society Clinical Research Scholar Award (CMB), en het National Cancer Institute (RO1 CA06150816; EJS).

Materials

Name of reagent Company Catalogue number
RPMI 1640 Invitrogen 21870-076
DC media CellGenix 20801-0500
EHAA (Click’s Medium) Irvine Scientific 9195
Human Serum Gemini Bio Products 100-110
Gas Permeable Cultureware18 Wilson-Wolf 80040S
IL-2 Chiron (TCH Pharmacy)  
IL-12 NCI/CTEP  
IL-15 CellGenix 1013-050
IL-7 R&D AFL207
IL-1beta R&D AFL201
IL-6 CellGenix 1004-050
GM-CSF TCH Pharmacy  
IL-4 R&D AFL204
TNF-alpha R&D AFL210
Ad5f35pp65 BCM CAGT Vector Production Facility  
Plasma transfer set with female luer adapter Charter Medical 89-550-66j
Lymphoprep Nycomed 1114550

References

  1. Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
  2. Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
  3. Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
  4. Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
  5. Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
  6. Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
  7. O’Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
  8. Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
  9. Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
  10. Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
  11. Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
  12. Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
  13. Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
  14. Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
  15. Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
  16. Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
  17. Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S39-S45 (2011).
  18. Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).

Play Video

Cite This Article
Hanley, P. J., Lam, S., Shpall, E. J., Bollard, C. M. Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus. J. Vis. Exp. (63), e3627, doi:10.3791/3627 (2012).

View Video