Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.
Bu protokol, bir hücre tabanlı bir sistem ve inhibitör / uyarıcı aktiviteye sahip bileşikler olası etkileri içinde moleküler şaperonlar enzimatik aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Moleküler şaperonlar 1 katlama protein yönetmelikte yer alan proteinler ve ısı şok 2, besin açlık ve kimyasallar / zehirler 3 maruz kalma gibi stres hakaretler üzerine hücre sağkalım teşvik çok önemli bir rol var. Bu nedenle şaperonlar tümör gelişimi, kanser hücreleri 4 chemioresistance yanı sıra nörodejenerasyon 5 gibi etkinliklere yer bulunur. Bu nedenle, bu enzimlerin aktivitesini inhibe veya teşvik etmek için küçük moleküllerin tasarımı, kanser tedavisi 7 ve nörodejeneratif hastalıkların 9 için en çok çalışılan stratejileri biridir. Burada açıklanan belirli bir moleküler şaperon refolding aktivitesini ölçmek ve comp etkisini araştırmak için tahlil imkanı sunarfaaliyet ounds. Bu yöntemde, incelenen moleküler şaperon gen ateşböceği lusiferaz gen ekspresyon vektörü kodlama ile birlikte transfekte. Zaten denatüre ateşböceği lusiferaz moleküler şaperonlar 10,11 refolded olabileceği tarif edilmiştir. Transfeksiyon kontrolü normalleştirilmesi gibi, renilla lusiferaz gen için bir vektör kodlama transfekte. Bu protokolü açıklanan tüm transfections HEK-293 hücrelerinde X-treme Gen 11 (Roche) ile yapılmaktadır. İlk adımda, protein sentezi, Siklohekzimidsiz hücrelerin tedavi inhibe edilir. Bundan sonra açığa çıkmasını protein 30 dakika boyunca 45 ° C'de ısı şok indüklenir. 37 ° kurtarma üzerine ° C, proteinler yeniden katlanmış ve onların aktif konformasyon ateşböceği lusiferaz faaliyet okuma olarak kullanılır: daha fazla ışık olacak, daha fazla protein orijinal konformasyon yeniden kazanmış olacaktır. Isıl şok hücreleri referans (refolded,% 100 olarak belirlenmiştirlusiferaz).
Bu çalışmada, moleküler şaperonlar içi refolding aktivitesini ölçmek için bir protokol sunulmuştur. Şekil bakış gösterildiği gibi tüm testi 3 ila 4 gün içinde yapılabilir. 1.
Ateş böceği ve renilla lusiferaz tarafından üretilen ışık sinyali sağlamlık ve doğrusallık, tekrarlanabilirlik protokol için sağlam bir temel temsil eder.
Testin kritik adım, moleküler hastabakıcı ve ateşböceği lusifer…
The authors have nothing to disclose.
Danilo Maddalo bir araştırma bursu, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü Genç Araştırmacı Grubu (YIG) olarak bir alıcı.
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
GLY-GLY-buffer:
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
Company | Catalog/Product Number: | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |