В этом протоколе метод измерения внутриклеточного белка рефолдинг после теплового шока описан. Этот метод может быть использован для изучения foldases как молекулярных шаперонов и их ко-факторы или соединений, способных влиять на их деятельность. Firefly активности люциферазы используется в качестве репортера для измерения активности шаперона рефолдинг.
Этот протокол описывает метод для измерения ферментативной активности молекулярных шаперонов в клеточной системе и возможные последствия соединений с тормозным / стимулирующей деятельности. Молекулярная шаперонов являются белки, участвующие в регуляции сворачивания белка 1 и играют решающую роль в обеспечении выживаемости клеток на стресс оскорбления, как тепловой шок 2, питательных голода и воздействия химических веществ / яды 3. По этой причине шаперонов оказываются вовлечены в события, как развитие опухоли, chemioresistance раковых клеток 4, а также нейродегенеративные 5. Дизайн малых молекул способен подавлять или стимулировать активность этих ферментов является одной из наиболее изученных стратегий для лечения рака 7 и нейродегенеративные расстройства 9. Анализ описанных здесь предлагает возможность измерения рефолдинг деятельности частности молекулярный шаперон и изучение влияния компounds о своей деятельности. В этом методе ген молекулярных шаперонов исследуемый трансфицированных вместе с кодировкой вектор экспрессии для генов люциферазы светлячка. Это уже описано, что денатурированный люциферазы светлячка можно сложил на молекулярных шаперонов 10,11. Как нормализации трансфекции контроля, вектор кодировки для renilla люциферазы гена трансфекции. Все трансфекции, описанные в этом протоколе выполнены с X-Treme Ген 11 (Roche) в НЕК-293 клеток. На первом этапе, синтез белка подавляется обработки клеток циклогексимид. После разворачивания белка индуцирована теплового шока при 45 ° С в течение 30 минут. После восстановления при 37 ° C, белки заново сложить в их активную конформацию и активность люциферазы светлячка используется в качестве считывания: больше света будет произведено, тем больше белка будет повторно приобрел оригинальную конформацию. Номера для тепла шокированы клетки устанавливаются в качестве справочных (100% сложиллюциферазы).
В этой работе протокол для измерения активности внутриклеточных рефолдинг молекулярных шаперонов представлена. Весь анализ может быть выполнен в 3-х до 4 дней, как показано на рис обзор. 1.
Надежность и линейность световой сигнал, и светлячка renilla люциферазы пред…
The authors have nothing to disclose.
Данило Maddalo является получателем исследования общения как группа молодых следователя (ЖИГ) из Карлсруэ технологический институт.
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
GLY-GLY-buffer:
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
Company | Catalog/Product Number: | |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |