שב וקיפל תאיים Assay
Summary
בפרוטוקול בשיטה זו כדי למדוד refolding חלבון תאיים לאחר הלם החום מתואר. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד foldases כמו מלווים המולקולרית שלהם שיתוף גורמים או תרכובות מסוגל להשפיע על פעילותם. פעילות גחלילית בלוציפראז משמש ככתב למדוד refolding פעילות המלווה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הפעילות האנזימטית של מלווים מולקולרית במערכת התא מבוסס ואת ההשפעות האפשריות של תרכובות בעלות פעילות המעכבת / מגרה. מלווים מולקולרית הם חלבונים המעורבים בוויסות של החלבון המתקפל 1 יש תפקיד מכריע בקידום ההישרדות תא הלחץ על עלבונות כמו מכת חום 2, רעב מזין וחשיפה לכימיקלים / רעלים 3. מסיבה זו מלווים הם מצאו להיות מעורבים באירועים כמו התפתחות הגידול, chemioresistance של 4 תאים סרטניים, כמו גם ניוון מוחיים 5. עיצוב של מולקולות קטנות מסוגל לעכב או להמריץ את הפעילות של אנזימים אלה ולכן הוא אחת האסטרטגיות ביותר למד לטיפול בסרטן ומחלות ניווניות 7 9. Assay המתואר כאן מציע את האפשרות למדוד את פעילות refolding של המלווה מולקולרי מסוים ללמוד את ההשפעה של compounds על פעילותה. בשיטה זו הגן של המלווה המולקולרי הוא נחקר transfected יחד עם קידוד ביטוי עבור וקטור הגן בלוציפראז גחלילית. היא תוארה כבר denaturated בלוציפראז גחלילית ניתן וקיפלתי על ידי מלווים מולקולרית 10,11. כמו נורמליזציה מלאה transfection, קידוד וקטור עבור הגן בלוציפראז renilla הוא transfected. Transfections כל המתואר בפרוטוקול זה מבוצעות עם X-treme ג'ין 11 (Roche) ב HEK-293 תאים. בשלב הראשון, סינתזת החלבון היא מעוכבת על ידי טיפול בתאי עם cycloheximide. לאחר מכן חלבון התגלגלות הוא המושרה על ידי הלם חום 45 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר התאוששות ב 37 ° C, חלבונים מחדש מקופל לתוך קונפורמציה פעילה שלהם את הפעילות של בלוציפראז גחלילית משמש לקריאה מתוך: האור יותר יופק, החלבון יותר יהיה מחדש זכתה קונפורמציה המקורי. ללא חום תאים בהלם מוגדרות כנקודת התייחסות (100% מכלל וקיפלתיבלוציפראז).
Protocol
Discussion
בעבודה זו בפרוטוקול כדי למדוד את פעילות refolding תאיים של מלווים מולקולרית מוצג. Assay כולו ניתן לבצע 3 עד 4 ימים כפי שמוצג על ידי סקירה של איור. 1.
עמידות ליניאריות של אות אור המיוצר על ידי גחלילית ואת בלוציפראז renilla מהווים בסיס ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
דנילו מדלו הוא מקבל מלגת מחקר כמו קבוצת לחוקר הצעיר (YIG) מהמכון הטכנולוגי של קרלסרוהה.
Materials
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer ‘1420 Luminescence Counter’ Vector Light′ was used
Programs for the Luminometer:
Renilla: Pump 1, 100 μl injection
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection
Luciferin: Pump2, 30μl injection
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water:
- – 1M MgSO4 : 246,48g MgSO4*7H2O in 1 liter
- – 0,5M EGTA: 190,18g EGTA in 1 liter
- – 1M KH2PO4: 136,09g KH2PO4 in 1 liter
- – 1M K2HPO4: 228,23g K2HPO4*3H2O in 1 liter
- – 5M NaCl: 292,2g NaCl in 1 liter
- – 0,5M EDTA: 186,12g EDTA*2H2O in 1 liter
GLY-GLY-buffer:
- – 25mM Glycylglycin
- – 15mM MgSO4
- – 4mM EGTA
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter.
Reaction buffer for Renilla/Coelenterazine buffer:
- – 13,4mM KH2PO4
- – 86,6mM KH2PO4
- – 0,5M NaCl
- – 1mM EDTA
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution.
| Company | Catalog/Product Number: | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent |
Roche | 06365809001 |
| PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X |
GIBCO | 14190-094 |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid |
SIGMA-ALDRICH | M1254 |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth |
G7278 3054.2 P027.1 |
KH2PO4 |
Roth Roth Roth Roth |
3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
| Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L. HSP90 and the chaperoning of cancer. Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. 17-AAG: mechanisms of antitumour activity. Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
