Sivrisinek örneklerden kalitesi sıtma parazit ve vektör DNA ayıklamak için bir hızlı ve ekonomik bir şekilde açıklanmıştır. Basit bir yöntem sivrisinek orta bağırsak ve tükürük bezi aşamalarında sıtma parazitlerinin genotipleme yanı sıra moleküler tanımlanması, Chelex reçine çelatlama özelliklerine etkinleştirir sermaye<em> Anofel</em> PCR ile türlerin kardeş.
Endemik ülkede giderek kontrol programlarının 1,2,3,4,5 ayrılmaz bir parçası olarak, verimli yazarak, tanımlama ve sıtma parazitleri ve vektör sivrisineklere karşı gözetim için moleküler araçlar benimsiyor. Işlemleri bu doğru yaklaşımların sürdürülebilir kurulması için sıtma ve hasis reaktif ve ekipman ihtiyaçları ile eleme çabaları, basit ve ekonomik yöntem, güçlendirmek için araştırma 6,7,8 gereklidir. Burada alanda toplanan sivrisinek örneklerden sıtma parazit ve vektör DNA ayıklamak için basit bir Chelex tabanlı tekniğinin sunulması.
Biz morfolojik 72 Anofel gambiae sl belirlenmiştir. Piretrum sprey Macha de Sıtma Enstitüsü 2.000 km 2 civarı içinde evlerin odalarında uyku yakalar tarafından yakalanan 156 sivrisinek. Diseksiyonu 72 Anofel gam için karından baş ve toraks ayırmak için sonrabiae sl. sivrisinekler, iki ayrı bölümden 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirilir ve deiyonize su içinde 20 ul batık edildi. Steril bir pipet ucu kullanarak, her bölüm ayrı ayrı sivrisinek deiyonize su içinde homojen bir süspansiyon ile homojenize edildi. 10 ul başka bir ayrı otoklavlanmış 1.5 ml tüpüne nakledilir iken her bir sivrisinek bölümünden sonraki Homojenat, 10 ul muhafaza edildi. Ayrı alikotları ekstraksiyon protokolü 9,10 salting out basitleştirilmiş Chelex veya standart ya tarafından DNA ekstraksiyonu tabi tutuldu. Bu DNA ekstraksiyon 9 sırasında protein çökeltme adımı için zararlı organik çözücüler (örneğin, fenol ve kloroform gibi) yerine yüksek tuz konsantrasyonları kullanır çünkü dışarı tuzlama protokol olarak adlandırılan ve yaygın olarak kullanılmaktadır.
Özler eklembacaklı mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrojenaz hedefleme primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu için şablon olarak kullanıldıKaraburun (NADH) altbirim 4 gen (ND4) Plasmodium falciparum enfeksiyonu 12 yazmak için DNA kalitesi 11, Anofel gambiae türler 10 tespiti için PCR ve nested PCR kontrol etmek. DNA kalitesi (ND4) kullanarak Karşılaştırma PCR kurulan dışarı tuzlama protokolü göreli Chelex yaklaşım için% 93 duyarlılık ve% 82 özgüllük gösterdi. Duyarlılık ve özgüllük Sorumlu değerleri P. için sırasıyla, türler tanımlama PCR ve% 92 ve% 80 ile, sırasıyla,% 100 ve% 78 idi falciparum tespiti PCR. Chelex veya düzenli her üç PCR uygulamalarında protokolü üzerinden tuzlama ile Amplikon sinyal vererek örneklerin oranları arasında anlamlı farklılık saptanmadı. Chelex yaklaşım üç basit reaktifler ve tamamlamak için 37 dakika gerekli iken bir gecede adım dahil, 10 farklı reaktifler ve 2 saat ve 47 dk 'işlem süresi gerektirdiği protokol üzerinde tuzlama. Bizim sonuçlarımız th gösterChelex yöntem de mevcut tuzlama dışarı çıkarma ile karşılaştırılabilir ve sabit bir reaktif tedarik zinciri çoğu kez muhafaza edilmesi güçtür kaynak sınırlı olduğu ortam içinde basit ve sürdürülebilir bir yaklaşım olarak ikame edilebilir.
Burada sunulan basitleştirilmiş Chelex yöntemi kalitesi Anopheles spp ve P. çıkarılması sağlar farklı PCR uygulamaları mükellef sivrisinek örneklerden falciparum DNA. Bu teknik, ilaca dirençli P. moleküler sıtma vektör sivrisinek tespiti ve gözetim için istihdam edilebilir ulusal sıtma kontrol programları için sivrisinekler falciparum allel. Basitleştirilmiş Chelex tekniğin avantajları basitlik, daha az reaktif ve dolayısıyla maliyet, güvenlik ve bu yöntemi 10 salting out (2 saat 47 dakika ve bir gecede adım, Tablo 1) gibi standart protokolleri daha kısa işlem süresi (37 dakika) bulunmaktadır. Söz konusu avantajlar ve minimal reaktif gereksinimleri (3 reaktifler) mevcut standart protokol (10 reaktifleri, Tablo 1) 11,15 karşılaştırıldığında, sabit reaktif endemik ülke laboratuvarları basitleştirilmiş Chelex protokolü özellikle kolay haletedarik zinciri çoğu kez sağlamak zordur. Yöntemin özel bir sınırlama standart protokol gibi, aynı zamanda sivrisinek zar 16 meydana geldiği bilinmektedir PCR inhibitörleri tabi olmasıdır. Bununla birlikte, bu kolayca deneylerinde BSA dahil edilmesi ile rahatlatılır. BSA de başarıyla diğer PCR uygulamaları 17,18 inhibitörleri karşı bir amplifikasyon artırıcı olarak istihdam edilmiştir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar şefleri, muhtarları ve sivrisinek alanında örnek koleksiyonları sırasında işbirliği onların unwaveing için Macha toplulukları borçluyuz. Dr Doug Norris ve Rebekah Kent üzerinden tuzlama protokol biçilmez bir uzmanlık sundu. Bu çalışma, Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü pilotu hibe sistemi tarafından finanse edildi. Sivrisinek ve parazit DNA laboratuvarında standartlara nazik MR4, Amerikan Tip Kültür & Koleksiyon tarafından bağışlandı.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |