يوصف وسيلة سريعة وبأسعار معقولة لاستخراج نوعية طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض. الاستفادة من خصائص مخلبية من راتنج Chelex، وطريقة بسيطة تمكن من التنميط الجيني طفيليات الملاريا في البعوض مراحل الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية، وكذلك تحديد الجزيئي لل<em> الأنوفيلة</em> الشقيق الأنواع من PCR.
البلدان الموبوءة يتم اعتماد متزايد الأدوات الجزيئية لكتابة كفاءة، وتحديد ومراقبة ضد طفيليات الملاريا والبعوض الحامل للمرض، باعتبارها جزءا لا يتجزأ من برامج سيطرتهم 1،2،3،4،5. لإنشاء هذه النهج المستدام للدقة في عمليات البحث لتعزيز جهود مكافحة الملاريا والقضاء، وطرق بسيطة ومعقولة التكلفة، مع كاشف بالبخل والاحتياجات من المعدات ضرورية 6،7،8. هنا نقدم بسيطة Chelex المستندة إلى تقنية لاستخراج طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض مجال جمع.
حددنا 72 شكليا الأنوفيلة الغامبية SL. من 156 البعوض التي استولت عليها عاقر قرحا رذاذ المصيد في غرف النوم من الأسر داخل المنطقة المجاورة 2 كم من 2000 معهد الملاريا في ماشا. بعد تشريح لفصل الرأس والصدر من البطن حركة اتشيه الحرة لجميع الأنوفيلة 72biae SL. البعوض، وضعت بشكل فردي القسمين في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge والمغمورة في 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. تلميح باستخدام ماصة معقمة، والمتجانس بشكل منفصل لكل قسم البعوض على تعليق موحد في الماء منزوع الأيونات. من جناسة الناجمة عن البعوض كل قسم، تقرر الإبقاء على 10 ميكرولتر بينما تم نقل الآخر إلى 10 ميكرولتر منفصلة تعقيمها أنبوب مل 1.5. تعرضت مأخوذة منفصلة لاستخراج الحمض النووي من قبل Chelex إما المبسطة أو معيار التمليح من استخراج بروتوكول 9،10. البروتوكول هو التمليح من ما يسمى ويستخدم بشكل واسع لأنه يعمل تركيزات عالية من الملح بدلا من المذيبات العضوية الخطرة (مثل الفينول وكلوروفورم) لهطول الأمطار خلال البروتين خطوة استخراج DNA 9.
واستخدمت مقتطفات كقوالب لتضخيم PCR باستخدام بادئات استهداف المفصلية الميتوكوندريا dehydroge نيكوتيناميد أدينين ثنائي النوكليوتيدnase (NADH) الوحيدات 4 الجين (ND4) للتحقق من جودة DNA 11، لPCR لتحديد الأنواع الأنوفيلة الغامبية 10 و الأخوة وPCR المتداخلة لكتابة الإصابة المنجلية 12. مقارنة باستخدام نوعية الحمض النووي (ND4) أظهرت حساسية PCR 93٪ والنوعية 82٪ للنهج Chelex نسبة إلى بروتوكول التمليح من المنشأة. وكانت القيم المقابلة من حساسية ونوعية 100٪ و 78٪ على التوالي، وذلك باستخدام الأنواع الأخوة PCR تحديد و92٪ و 80٪ على التوالي لP. المنجلية الكشف PCR. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في نسبة العينات إعطاء إشارة AMPLICON مع Chelex أو التمليح العادية من البروتوكول في جميع التطبيقات PCR الثلاثة. النهج Chelex حاجة إلى ثلاث الكواشف بسيطة و 37 دقيقة لإكمال، في حين أن. التمليح من البروتوكول ينطوي 10 الكواشف المختلفة و 2 ساعة 47 دقيقة والوقت "معالجة، بما في ذلك خطوة ليلة وضحاها نتائجنا تظهر الفي طريقة مماثلة لChelex استخراج التمليح من القائمة ويمكن أن تكون بديلا عن مقاربة بسيطة ومستدامة في الأماكن المحدودة الموارد حيث إمدادات ثابتة كاشف سلسلة غالبا ما يكون من الصعب الحفاظ عليها.
طريقة مبسطة Chelex المقدمة هنا يمكن استخلاص نوعية الأنوفيلة SPP وP. المنجلية DNA من عينات البعوض قابلة للتطبيقات PCR متنوعة. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد الجزيئية من البعوض ناقل الملاريا ومراقبة المقاوم للأدوية P. المنجلية الأليلات في البعوض عن البرامج الوطنية لمكافحة الملاريا. مزايا تقنية مبسطة تشمل Chelex بساطة، أقل تكلفة، وبالتالي الكواشف والسلامة وزمن أقصر (37 دقيقة) من البروتوكولات القياسية مثل التمليح من طريقة 10 (2 دقيقة 47 ساعة وخطوة ليلة وضحاها، الجدول 1). المزايا المذكورة أعلاه ومتطلبات الحد الأدنى من كاشف (3 الكواشف) مقارنة بروتوكول المعيار الحالي (10 الكواشف، الجدول 1) 11،15، وجعل البروتوكول Chelex مبسطة ودية خاصة إلى المختبرات البلاد الموبوءة حيث كاشف ثابتسلسلة التوريد في كثير من الأحيان من الصعب الحفاظ عليها. وجود قيود على الطريقة التي مثل بروتوكول قياسي، فإنه يخضع أيضا لمثبطات PCR المعروف أن يحدث في إهاب البعوض 16. ومع ذلك، يخلص بسهولة عن طريق إدراج BSA في المقايسات. كما تم استخدامها بنجاح كما BSA محسن التضخيم ضد مثبطات في تطبيقات PCR الأخرى 17،18.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب مدينون لجهاء وشيوخ والمجتمعات من ماشا لunwaveing في التعاون خلال البعوض مجموعات عينة المجال. تقدم الدكتور دوغ نوريس وكنت رفقة الخبرات لا تقدر بثمن على بروتوكول التمليح بها. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جونز هوبكنز الملاريا معهد بحوث نظام المنح الرائدة. تم التبرع بها البعوض والطفيليات التكرم معايير المختبر حسب نوع DNA، MR4 الأمريكية والتحصيل الثقافة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |