Un modo rapido e conveniente per estrarre parassita della malaria qualità e il DNA da campioni di zanzara vettore è descritto. Capitalizzando proprietà chelanti di resina Chelex, il semplice metodo consente genotipizzazione dei parassiti della malaria in fasi zanzara ghiandole mid-intestinali e salivare, nonché identificazione molecolare del<em> Anopheles</em> Sibling specie mediante PCR.
Paesi endemici stanno sempre più adottando strumenti molecolari per la tipizzazione efficiente, identificazione e sorveglianza contro i parassiti della malaria e le zanzare vettore, come parte integrante dei loro programmi di controllo 1,2,3,4,5. Per la creazione sostenibile di questi approcci precisi nelle operazioni di ricerca per rafforzare il controllo della malaria e gli sforzi di eliminazione, metodi semplici e convenienti, con reagente parsimoniosa e alle attrezzature sono essenziali 6,7,8. Qui vi presentiamo una semplice Chelex tecnica basata per l'estrazione parassita della malaria e il DNA da campioni di zanzara vettore raccolti sul campo.
Abbiamo identificato morfologicamente 72 Anopheles gambiae sl. Da 156 zanzare catturate dalla piretro spruzzo catture accessorie nelle camere da letto delle famiglie all'interno di un km 2.000 2 pressi dell'Istituto malaria a Macha. Dopo la dissezione, per separare la testa e il torace dall'addome per tutti Anopheles 72 gambiae sl. zanzare, le due sezioni sono state singolarmente messo in tubi microcentrifuga da 1,5 ml e immerso in 20 ml di acqua deionizzata. Usando una pipetta sterile, ogni sezione zanzara stato omogeneizzato separatamente ad una sospensione uniforme in acqua deionizzata. Dell'omogenato derivanti da ciascuna sezione zanzara, 10 microlitri è stata conservata mentre l'altro 10 microlitri è stato trasferito ad una provetta separata autoclavata 1,5 ml. Le aliquote separate sono stati sottoposti ad estrazione del DNA sia dal Chelex semplificata o lo standard salting out estrazione protocollo 9,10. Il protocollo salting out è il cosiddetto e ampiamente utilizzati perché impiega elevate concentrazioni saline in luogo di pericolosi solventi organici (come fenolo e cloroformio) per la fase di precipitazione della proteina durante l'estrazione del DNA 9.
Gli estratti sono stati utilizzati come modelli per l'amplificazione PCR utilizzando primers mirati artropodi mitocondriale dehydroge nicotinammide-adenina-dinucleotidenase (NADH) subunità 4 gene (ND4) per verificare la qualità del DNA 11, una PCR per l'identificazione di specie Anopheles gambiae fratelli 10 e un nested PCR per la tipizzazione di infezione da Plasmodium falciparum 12. Confronto con qualità del DNA (ND4) PCR ha mostrato il 93% di sensibilità e specificità 82% per l'approccio Chelex relativo alla stabilita salatura fuori protocollo. Corrispondenti valori di sensibilità e specificità sono state del 100% e 78%, rispettivamente, con fratello identificazione delle specie PCR e il 92% e 80%, rispettivamente, per P. falciparum rilevamento PCR. Non ci sono state differenze significative nella percentuale di campioni che con il segnale amplificato Chelex o il regolare salatura su protocollo in tutte e tre le applicazioni PCR. L'approccio Chelex richiesto tre reagenti semplici e 37 min per completare, mentre la salatura su protocollo ha comportato 10 diversi reagenti e 2 ore e 47 min il tempo di elaborazione ', tra cui un passo durante la notte. I nostri risultati mostrano °al metodo Chelex è paragonabile a quella esistente salting out estrazione e può essere sostituito da un approccio semplice e sostenibile in risorse limitate, dove una costante filiera reagente è spesso difficile da mantenere.
Il metodo semplificato Chelex qui presentato permette l'estrazione di qualità Anopheles spp e P. falciparum DNA da campioni di zanzara suscettibili di diverse applicazioni PCR. Questa tecnica può essere utilizzata per l'identificazione molecolare di zanzare vettore malaria e la sorveglianza della farmaco-resistenti P. alleli falciparum in zanzare per i programmi nazionali di controllo della malaria. I vantaggi della tecnica Chelex semplificata includono semplicità, meno reattivi e quindi dei costi, sicurezza e tempi di lavorazione più brevi (37 min) di protocolli standard quali il salting out metodo 10 (2 h 47 min e un passo overnight, Tabella 1). I vantaggi di cui sopra ed i requisiti minimi dei reagenti (3 reagenti) rispetto al protocollo standard attuale (10 reagenti, Tabella 1) 11,15, rendono il protocollo Chelex semplificato particolarmente cordiale ai laboratori dei paesi endemici in cui un reagente costantefiliera è spesso difficile da mantenere. Una limitazione del metodo è che, come il protocollo standard, è stato anche oggetto di inibitori della PCR noti a verificarsi nel tegumento zanzara 16. Tuttavia, questo è facilmente alleviato inclusione di BSA nei saggi. BSA è stata utilizzata con successo come amplificazione enhancer contro inibitori in altre applicazioni PCR 17,18.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori sono in debito con i capi tribù, capi e le comunità di Macha per la loro collaborazione nel corso unwaveing collezioni zanzara campione sul campo. Il dottor Doug e Rebecca Norris Kent offerto competenze di alta qualità sul protocollo salatura fuori. Questo lavoro è stato finanziato dalla Johns Hopkins Malaria Research Institute sistema pilota di sovvenzione. Mosquito e parassiti del DNA standard di laboratorio sono stati gentilmente donati da MR4, tipo American & Culture Collection.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |