הפרוטוקול מסוכם באיור. 4. 1. איסוף דגימות דם איסוף דם מ"ל לפחות 3 בצינורות EDTA באתר הקליני. הדוגמות ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 ° C. שלח את דגימות דם EDTA-ההקדם האפשרי למעבדה בדואר רגיל. 2. בידודו של נגיף RNA ו / או DNA השג רנ"א הנגיפי ו / או דנ"א מדם כל 1000 μl, סרום או פלזמה, שימוש בבידוד Magna הטהור הקומפקטי חומצות הגרעין שערכה אני ומערכת הקומפקטית הטהורה Magna. Elute רנ"א או דנ"א זכה בחיץ TE 50 μl. לחלופין, תהליכי טיהור אחרות גרעין חומצות עשויים לשמש. 3. הגברה של אזור env Amplify אזור env (איורים 2 ו 4) משתי הפלזמה RNA או DNA proviral. 1245 מוצר BP-ארוך, הכולל את רוב חלבון Env (NT 6556-7811 accordinגרמתי לHXB2) שנוצר. דגימות RNA: תגובת RT-PCR רנ"א הנגיפי מציג מבנה משני מורכב מאוד (איור 4) שעשוי לעכב את תגובת RT. כדי להימנע מבעיה זו, דגירת 10 RNA μl על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (כבר בצינור PCR ובמכונת PCR) ולאחר מכן מוריד את הטמפרטורה ל 50 מעלות צלזיוס הוסף 40 μl של מיקס מאסטר כולל PCR primers Env-F וEnv-R. מיקס מאסטר לRT-PCR בבית, מערכת: נפח / תגובה (μl) ריכוז סופי RNase ללא H 2 O 14.4 מאגר 5x (Qiagen OneStep RT-PCR קיט) 10 1x 5x Q-פתרון 10 1x dNTP מיקס (10 מ"מ כל אחת) <td> 2 400 מיקרומטר של כל dNTP Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR קיט) 2 פריימר Env-F (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר פריימר Env-R (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר RNase אינהיביטור (RNasin) 1 5 יחידות / תגובה Env-F: -3 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA "(6556 nt → 6586 פי HXB2) Env-R: -3 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC '(NT 7785 ← 7811) הפעל את תגובת RT ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הפעל את ה-PCR 1 כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס, 15 דקות X 1 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות 50 מעלות צלזיוס, 30 שניות 72 מעלות צלזיוס, 2 דקות </tד> X 1 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות 56 ° C, 30 שניות 72 מעלות צלזיוס, 2 דקות 38 x 72 ° C, 10 דקות 4 מעלות צלזיוס ∞ דגימות DNA: תגובת PCR לדגימות DNA proviral, שום תגובת RT ראשונית דרושה, ותגובת PCR ישירות יכולה להתחיל. הוסף 40 μl של מיקס מאסטר PCR עד 10 μl של DNA provial. מאסטר מיקס לPCR בבית, מערכת: נפח / תגובה (μl) ריכוז סופי RNase ללא H 2 O 15.4 מאגר 5x (DNA פולימראז HotStarTaq) 10 1x 5x Q-פתרון 10 1x dNTP מיקס (10 מ"מ כל אחת) 2 400 מיקרומטר של כל dNTP Enzym-Mix (DNA פולימראז HotStarTaq) 2 פריימר Env-F (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר פריימר Env-R (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר Env-F: -3 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA "(6556 nt → 6586) Env-R: -3 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC '(NT 7785 ← 7811) הפעל את תנאי PCR כפי שתואר לעיל עבור דגימות RNA (שלב 3.1.4). 4. הגברה של אזור V3: PCR המקונן לPCR המקונן, השתמש 5 μl מתגובת PCR הראשונה (ללא ניתוח קודם בagarose ג'ל) כתבנית ולהוסיף 95 μl של מאס PCRמערבב ter. מיקס מאסטר ל- בית המקונן בPCR נפח / תגובה (μl) ריכוז סופי H 2 O 61.9 מאגר PCR 10x 10 1x 5x Q-פתרון 20 1x dNTP מיקס (10 מ"מ כל אחת) 2 200 מיקרומטר של כל dNTP פריימר Env-2F (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר פריימר Env-2R (100 מיקרומטר) 0.3 0.6 מיקרומטר פולימראז ה-DNA HotStarTaq 0.5 2,5 יחידות / תגובה Env-2F: -3 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC "(6838 nt → 6864) <strong>-2R Env: -3 5'-CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC '(NT 7712 ← 7742) הפעל את ה-PCR כדלקמן: 93 ° C, 15 דקות X 1 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות 50 מעלות צלזיוס, 30 שניות 72 מעלות צלזיוס, 90 שניות X 1 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות 56 ° C, 30 שניות 72 מעלות צלזיוס, 90 שניות 43 x 72 ° C, 10 דקות 4 מעלות צלזיוס ∞ לנתח את מוצר PCR ב% agarose ג'ל 1 (איור 4). המוצר הצפוי הוא 902 נ"ב ארוכים. טיהור של דגימות רצף. לטהר את מוצר PCR עם ערכת Qiagen PCR-הטיהור, באמצעות פרוטוקול, פתרונות ועמודות מייקרו סופק על ידי הספק. Elute במאגר PE 30-100 μl, תלוי בעוצמת להקה. לחלופין, הדגימות יכולות להיות מטוהרות באמצעות exonucleaseאני והמהיר AP (Thermo אלקליין phosphatase). לצורך כך, להוסיף 6 מיקס μl Exo-AP למוצר ה-PCR 15 μl ודגירה 15 דקות בשעת 37 ° C. 580 μl H 2 O 66 μl AP המהיר 13.4 Exo μl אני 5. תגובת רצף של amplicon V3 תגובת הרצף מורכב מתגובת PCR רק באמצעות אחד מפריימרים הבאים: Env-2: -3 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC (NT 6959 → 6980) Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA – 3 '(NT 7352 ← 7371) Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC – 3 '(6979 nt → 7000) Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC – 3 '(NT 7530 ← 7549) Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC – 3' (NT 7478 ← 7507) Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC – 3' (NT 7638 ← 7664) פריימרים בחירה ראשונים הם: Env-2, Env-6 או Env-7, Env-11 השתמש μl 1 מ amplicon V3 המטוהר כתבנית ולהוסיף 9 μl של אדון תערובת PCR. סידור מיקס מאסטר: 4 תמהיל הרצף μl (HIV-genotyping קיט) 4 μl H 2 O 1 פריימר μl (100 pmol / μl) הפעל את תגובת הרצף כדלקמן: 96 מעלות צלזיוס, 10 שניות 50 מעלות צלזיוס, 10 שניות 36 x 60 ° C, 45 שניות 4 מעלות צלזיוס ∞ 6. טיהור של דגימות הרצף לטהר רצפים USIng Sephadex G-50 עדינים במיוחד. מלא את המספר המתאים של בארות ב" מטעין העמודה "עם G-50 superfine Sephadex. העברת Sephadex לMAHVN4510 צלחת הסינון לפי מתהפך. הוסף 300 מילים-Q H 2 O μl לכל באר בצלחת המסנן, ומדגיר אותו ל3h לפחות 2-8 מעלות צלזיוס צנטריפוגה הצלחות עבור 5 דקות ב910Xg ו4-15 ° C. השלך את הזרימה דרך. הוסף 10 μl H 2 O למוצר ולאחר מכן רצף pipet הרצף על צלחת Sephadex התנפחה. כדי לקבל את המוצר המטוהר, סרכזת הצלחת למשך 5 דקות. ב910Xg ו4-15 מעלות צלזיוס ולאסוף זרימה דרך. 7. סידור את הדגימות המטוהרות ברצף ABI פריזמה 3130 XL לפני כל ריצה, לשנות את החיץ ובדוק את עוצמת הקול של הפולימר (POP7). במידת צורך, להחליף את בקבוק הפולימר הישן באחד חדש. השתמש בתנאים לרוץ נשמרו, כולל זמן הזרקה של 18 שניות. במכונה הזאת, האוסף של נתוני האותות של ריצה אחת עם 16 דגימות רצף לוקח בערך 60 דקות (36 סנטימטרי נימים) או 150 דקות (50 סנטימטרי נימים). 8. עריכת רצף השתמש בתכנית Lasergene (DNA-Star) כדי ליישר ולערוך את הרצפים (איור 5). תוכניות עריכת רצף אחרות עשויות להיות בשימוש. השתמש "B-V3 הסכמה" ורצף קונסנסוס env כהפניות. Lasergene יוצר רצף קונסנסוס של המדגם נתח משתמש בכל נתוני הגלם זמין ולאחסן אותו כקובץ FASTA. קובץ FASTA הוא קובץ טקסט הכולל את כותרת עם השם של המדגם ורצף נוקליאוטידים. 9. סידור נתונים לפרשנות וחיזוי כמיהות סידור פרשנות נתונים מתבצע על ידי מערכת הפרשנות מבוססת האינטרנט geno2pheno [coreceptor] (http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). לניבוי הכמיהות, הגדרות FPR שונות ניתן לבחור. הגדרת ברירת המחדל היא על פי הנחיות הטיפול הגרמני האוסטריות. לFPR ≥ 20%, הנגיף מסווג כR5 כאשר FPR ≥ 20% וX4 לFPR <12.5%. העלה את הקובץ לשרת FASTA. שרת זה מתרגם את רצף נוקליאוטידים לחומצות אמינו, מיישר אותו ברצף ב-V3 הקונצנזוס ומייצר תת סיווג. בנוסף, הוא מייצר ניבוי של שימוש coreceptor (איור 4) מבוטא בשיעור חיובי כוזב (FPR). 10. נציג תוצאות Geno2pheno [coreceptor] הפלט מציג פרשנות מדורגת של הכמיהות. בהתאם לסבירות של שימוש coreceptor, טקסט הפרשנות וצבע רקע משתנים מירוק (<FPR 20%), טוענים ממשל בטוח לMVC, לצהוב, מה שמראה סיכון אפשרי, נמוך ולבסוף לאדום. אדום הוא הצבע מציעing לא לרשום MVC. בנוסף, השרת יוצר דוח PDF הניתן להדפסה, מלא עם נתונים לדוגמה ומטופל, ונשלח לרופא. דוגמאות לgeno2pheno [coreceptor] תפוקה מתוארות באיור. 6. איור. 1. שכפול סכמטי של נגיף איידס. virion חייבת לאגד את CD4 הסלולרי כקולט ומשני CCR5 או CXCR4 כcoreceptor. Coreceptor CCR5 יכול להיחסם עם יריבי CCR5 כמו Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). לאחר האיחוי של קרומים הנגיפיים ותאיים, nucleocapsid הנגיפי הוא שוחרר בציטופלסמה. Nucleocapsid מפרק והמורכב רנ"א הנגיפי הוא משוחרר לציטופלסמה. Transcriptase ההפוכה הנגיפית (RT) מעתיקה את הרנ"א הגנומי אל תוך הדנ"א proviral, אז שהוא מועבר לגרעין ומשתלב בגנום המארח על ידי אינטגראז-HIV. הנייד רנ"א polymerases transcribe גנומי הנגיפי וRNAs שליח מהגנום proviral. החלבונים הנגיפיים מיוצרים בציטופלסמה והובלו לתא השטח. ניצן חלקיקי הנגיף כvirions לא בוגר, שאינו מזהם מהתאים. פרוטאז ה-HIV חותך את החלבונים לייצור חלקיקים מזהמים. עיכוב של אחד השלבים מובילים להפסקת מחזור השכפול. את התרופות התרופתיות והצעד שהם מעכבים את השכפול מסומנות באדום. רנ"א הנגיפי DNA proviral (חומר המשמש לניתוח זיקה או התנגדות) מסומנים בירוק. איור 2. הגנום proviral איידס. חלקיקי HIV בנוי עם חלבונים מבניים שונים ובתי אנזימים שונים וחלבונים מהמקור נגיפי והן סלולרי. תכנית הדמותזה את המיקום של הגנים בתוך הגנום הנגיפי. משטח חלבוני gp120 ו gp41 מהווים קוצים על פני השטח של virion ולפנות לתא האנושי כדי לבצע את תהליך האיחוי. בחלק התחתון של הדמות, את מוצרי הגברת PCR וprimers המשמש בפרוטוקול שלנו מוצגים. איור 3. שיעור חולים עם עומס נגיפי נמוך (VL) מדידות נתחו לסמי התנגדות או קביעת זיקה במכון לווירולוגיה, אוניברסיטת קלן (גרמניה). איור 4. מערך כולל של הניסוי .. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5. רצף עריכה עם Lasergene. Amplicon V3 הוא רצף עם לפחות אחת קדימה ופריימר הפוך אחד. Lasergene alignes את קבצי ". ABI" מתקבלים מהרצף עם התייחסות הרצפים "V3-Consensus B" וenv. Lasergene יוצר רצף קונסנסוס משתמש בכל נתוני השורה הזמינות. רצפי ההתייחסות יכולים להיות מסומנים (ולאחר מכן מוצג באפור), כך שהם לא תורמים לרצף קונסנסוס המדגם. איור 6. דיווחי חיזוי כמיהות שנוצרו על ידי geno2pheno [coreceptor] דיווחי tool.The נוצרים כקבצי PDF שניתן לשמור וסיימו במחשב. נתונים נוספים שמו של המטופל כגון, מועד שאיבת דם, וכו ', ניתן לכלול באופן ידני באמצעות תכנית סופר pdf. הערות ספציפיות יכולות להיות גם הוסיפה. Thesנתונים אלקטרוניים הם אך ורק על המחשב של המשתמש ולא על geno2pheno [coreceptor] השרת. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של נתון זה.