Summary

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Published: October 29, 2011
doi:

Summary

Kafesli bileşiklerin Fotoliz çeşitli fizyolojik aktif bileşiklerin konsantrasyonu hızlı ve yerelleştirilmiş artar üretimi sağlar. Burada, kafesli cAMP fotoliz ile kombine veya ayrışmış bir fare koku alma duyusal nöronlarda koku iletimi çalışma için Ca kafesli patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir.

Abstract

Kafesli bileşiklerin Fotoliz hızlı ve yerelleştirilmiş çeşitli fizyolojik olarak aktif bileşikler 1 konsantrasyonu artar üretimi sağlar. Kafesli bileşikler, ultraviyole ışığın bir flash kırılmış olabilir kimyasal bir kafes tarafından fizyolojik olarak inaktif hale moleküllerdir. Burada, ayrışmış fare koku alma duyu nöronlar koku iletimi çalışması için kafesli bileşiklerin fotoliz ile birlikte patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir. Reseptörlerine bağlanarak odorant siklik nükleotid kapılı (CNG) kanal 2 açılır cAMP artışına yol açan koku alma duyu nöronlar, kirpikler, koku alma transdüksiyon işlemi (Şekil 1) yer alır . Ca CNG kanallar aracılığıyla giriş aktive Ca-Cl kanalları harekete geçirir. Biz, fare olfaktör epitel 3 ve kafesli cAMP 4 fotoliz veya Ca 5 kafesli CNG kanalları ya da Ca-aktive Cl kanalları nasıl aktif hale getirmek için nöronların nasıl ayırmak </> Destek. Biz tam hücreli gerilim kelepçe yapılandırma 8-11 patch-klemp kayıtları mevcut ölçmek için alınır uncage cAMP veya Ca ultraviyole yanıp söner siliyer bölgeye uygulamak için bir flash lamba 6,7 kullanın.

Protocol

1. Instrumentation To measure the response of olfactory sensory neurons to photolysis of caged compounds we use a flash lamp in combination with a typical patch-clamp recording system including: a patch-clamp amplifier, a recording electrode and a reference electrode connected to the head-stage of a patch-clamp amplifier, a digitizer, a computer, software for data acquisition, micro-manipulators, an epifluorescence microscope, a perfusion system, an anti-vibration table and a Faraday cage (Figure 2). <li…

Discussion

Patch-klemp kayıtları ile birlikte kafesli bileşiklerin Flash fotoliz konsantrasyonu fizyolojik olarak aktif moleküllerin hem iç ve dış hücreleri hızlı ve yerel atlar elde etmek için çok kullanışlı bir tekniktir. Kafesli compounds1 çeşitli türlerde sentezlenen olmuştur ve bu tekniğin, kültür hücreleri aktive olabilir veya bazı kafesli bileşikler 11 fotoliz tarafından modüle iyon kanalları ifade de dahil olmak üzere hücreleri, çeşitli türleri için uygulanabilir.

<p class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Equipment Company Catalogue number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70  
Air table TMC MICRO-g 63-534  
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A  
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8  
Data Analysis Software WaveMetrics Igor  
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100  
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U  
Faraday’s cage Custom made    
Filter cube Olympus U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2  
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments 14099  
Glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4  
Glass bottom dish World Precision Instruments FD35-100  
Illuminator Olympus Highlight 3100  
Inverted microscope Olympus IX70  
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I  
Micropipette Puller Narishige PP-830  
Monitor HesaVision MTB-01  
Neutral density filters Omega Optical varies  
Objective 100X Zeiss Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400  
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B  
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA  
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments AGT1025  
Silver ground pellet Warner instruments 64-1309  
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML  

Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma C7275
CsCl Sigma C4036
DMSO Sigma D8418
DNAse I Sigma D4527
EDTA Sigma E9884
EGTA Sigma E4378
Glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
KCl Sigma P3911
KOH Sigma P1767
Leupeptin Sigma L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma P3125
Poly-L-lysine Sigma P1274
NaCl Sigma S9888
NaOH Sigma S5881
NaPyruvate Sigma P2256

References

  1. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
  2. Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
  3. Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
  4. Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
  5. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
  6. Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
  7. Gurney, A. M., Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. , (1991).
  8. Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
  9. Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
  10. Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
  11. Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
  12. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
  13. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
  14. Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).

Play Video

Cite This Article
Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

View Video