Summary

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Published: October 29, 2011
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Summary

Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de cAMP gaiola ou enjaulado Ca para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos.

Abstract

Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos 1. Caged compostos são moléculas feitas fisiologicamente inativo por uma gaiola química que pode ser quebrado por um flash de luz ultravioleta. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de compostos enjaulado para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos. O processo de transdução olfativos (Figura 1) ocorre nos cílios dos neurônios sensoriais olfativos, onde odorant ligação aos receptores leva ao aumento de cAMP que abre nucleotídeo cíclico-gated (CNG) canais 2. Ca entrada através de canais CNG ativa os canais de Ca-activated Cl. Mostramos como dissociar os neurônios do epitélio olfativo do mouse 3 e como ativar canais CNG ou canais de Ca-Cl ativado por fotólise de cAMP enjaulado enjaulados Ca 4 ou 5 </ Sup>. Nós usamos uma lâmpada de flash 6,7 aplicar flashes ultravioleta à região ciliar para libertar da gaiola ou cAMP Ca enquanto patch-clamp gravações são tomadas para medir a corrente em toda a configuração de tensão de células-clamp 11/08.

Protocol

1. Instrumentation To measure the response of olfactory sensory neurons to photolysis of caged compounds we use a flash lamp in combination with a typical patch-clamp recording system including: a patch-clamp amplifier, a recording electrode and a reference electrode connected to the head-stage of a patch-clamp amplifier, a digitizer, a computer, software for data acquisition, micro-manipulators, an epifluorescence microscope, a perfusion system, an anti-vibration table and a Faraday cage (Figure 2). <li…

Discussion

Flash fotólise de compostos enjaulado combinado com patch-clamp gravações é uma técnica útil para obter saltos rápidos e local da concentração de moléculas ativas fisiologicamente dentro e fora das células. Vários tipos de compounds1 enjaulado foram sintetizados, e esta técnica pode ser aplicada a vários tipos de células, incluindo células cultivadas expressar canais iônicos que podem ser ativadas ou moduladas por fotólise de alguns dos compostos disponíveis enjaulado 11.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Equipment Company Catalogue number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70  
Air table TMC MICRO-g 63-534  
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A  
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8  
Data Analysis Software WaveMetrics Igor  
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100  
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U  
Faraday’s cage Custom made    
Filter cube Olympus U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2  
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments 14099  
Glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4  
Glass bottom dish World Precision Instruments FD35-100  
Illuminator Olympus Highlight 3100  
Inverted microscope Olympus IX70  
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I  
Micropipette Puller Narishige PP-830  
Monitor HesaVision MTB-01  
Neutral density filters Omega Optical varies  
Objective 100X Zeiss Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400  
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B  
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA  
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments AGT1025  
Silver ground pellet Warner instruments 64-1309  
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML  

Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma C7275
CsCl Sigma C4036
DMSO Sigma D8418
DNAse I Sigma D4527
EDTA Sigma E9884
EGTA Sigma E4378
Glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
KCl Sigma P3911
KOH Sigma P1767
Leupeptin Sigma L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma P3125
Poly-L-lysine Sigma P1274
NaCl Sigma S9888
NaOH Sigma S5881
NaPyruvate Sigma P2256

References

  1. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
  2. Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
  3. Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
  4. Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
  5. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
  6. Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
  7. Gurney, A. M., Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. , (1991).
  8. Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
  9. Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
  10. Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
  11. Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
  12. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
  13. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
  14. Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).

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Cite This Article
Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

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