Summary

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Published: October 29, 2011
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Summary

La photolyse de composés en cage permet la production d'une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de l'AMPc en cage ou en cage Ca pour l'étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs.

Abstract

La photolyse de composés en cage permet la production d'une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs 1. Caged composés sont des molécules composées physiologiquement inactive par une cage chimique qui peut être rompu par un éclair de lumière ultraviolette. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de composés en cage pour l'étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs. Le processus de transduction olfactive (Figure 1) se déroule dans les cils olfactifs des neurones sensoriels, où se liant aux récepteurs odorants conduit à l'augmentation de l'AMPc qui ouvre des nucléotides cycliques-dépendants (CNG) des canaux 2. D'entrée de Ca par les canaux CNG active les canaux Cl Ca-activé. Nous montrons comment dissocier les neurones de l'épithélium olfactif de souris 3 et comment activer les canaux CNG ou Ca-Cl activé les canaux par photolyse de l'AMPc en cage en cage 4 ou 5 Ca </ Sup>. Nous utilisons une lampe flash 6,7 à appliquer clignote ultraviolets pour la région ciliaire à uncage AMPc ou Ca alors de patch-clamp enregistrements sont prises pour mesurer le courant dans la cellule entière voltage-clamp de configuration 8-11.

Protocol

1. Instrumentation To measure the response of olfactory sensory neurons to photolysis of caged compounds we use a flash lamp in combination with a typical patch-clamp recording system including: a patch-clamp amplifier, a recording electrode and a reference electrode connected to the head-stage of a patch-clamp amplifier, a digitizer, a computer, software for data acquisition, micro-manipulators, an epifluorescence microscope, a perfusion system, an anti-vibration table and a Faraday cage (Figure 2). <li…

Discussion

Photolyse de composés en cage combiné avec des enregistrements de patch-clamp est une technique utile pour obtenir des sauts rapides et locales de la concentration de molécules actives physiologiquement à l'intérieur et l'extérieur des cellules. Plusieurs types de composés1 cage ont été synthétisés, et cette technique peut être appliquée à divers types de cellules, y compris les cellules en culture exprimant les canaux ioniques qui peuvent être activées ou modulée par photolyse de certains des c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Equipment Company Catalogue number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70  
Air table TMC MICRO-g 63-534  
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A  
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8  
Data Analysis Software WaveMetrics Igor  
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100  
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U  
Faraday’s cage Custom made    
Filter cube Olympus U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2  
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments 14099  
Glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4  
Glass bottom dish World Precision Instruments FD35-100  
Illuminator Olympus Highlight 3100  
Inverted microscope Olympus IX70  
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I  
Micropipette Puller Narishige PP-830  
Monitor HesaVision MTB-01  
Neutral density filters Omega Optical varies  
Objective 100X Zeiss Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400  
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B  
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA  
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments AGT1025  
Silver ground pellet Warner instruments 64-1309  
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML  

Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma C7275
CsCl Sigma C4036
DMSO Sigma D8418
DNAse I Sigma D4527
EDTA Sigma E9884
EGTA Sigma E4378
Glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
KCl Sigma P3911
KOH Sigma P1767
Leupeptin Sigma L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma P3125
Poly-L-lysine Sigma P1274
NaCl Sigma S9888
NaOH Sigma S5881
NaPyruvate Sigma P2256

References

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Cite This Article
Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

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