형광단 개발 및 이미징 기술, 바이러스가 바이러스와 세포 사이의 초기 상호 작용을 시각화하기 위해 고안되었다 뎅그열의 알렉사 플루어 라벨링의 간단한 방법에있는 발전을 활용.
Abstract
바이러스와 세포 사이의 상호 작용의 초기 이벤트는 감염의 결과에 지대한 영향을 가질 수 있습니다. 이 상호 작용에 영향을 미치는 요인을 결정하는 것은 질병 pathogenesis 개선 이해로 이어질 때문에 예방이나 치료 설계에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서,이 상호 작용을 조사하는 방법의 개발이 유용할 것입니다. fluorophores 개발 1-3 및 이미징 기술 4 최근 발전은 뎅그열 pathogenesis에 대한 현재의 지식을 개선하기 때문에 매년 발생하는 뎅그열 감염의 수백만을 줄이기 위해 방법을 포장에 이용하실 수 있습니다.
싸여 뎅그열 바이러스는 단일 가닥 RNA 긍정적인 게놈 5가 들어있는 nucleocapsid 껍질을 보호 90 봉투 당단백질 (E) dimers 구성된 외부 비계를 타고있다. 바이러스 표면에 동일한 단백질 subunits 따라서 아민 반응 염료로 분류하고 immunofluorescent 현미경을 통해 시각 수 있습니다. 여기, 우리는 알렉사 플루어 succinimidyl 에스테르 염색가 라벨 후 높은 가능한 바이러스를 굴복 나트륨 중탄산염 버퍼에 직접 용해와 뎅그열 바이러스의 라벨링의 간단한 방법을 제시한다. 라이브 바이러스 및 단백질 라벨은 보통 디메틸 sulfoxide의 색소의 reconstitution을 필요로 기존 제조 업체의 프로토콜의 라벨에 대한 표준화된 절차가 없습니다. 디메틸 sulfoxide의 존재, 심지어 분 수량에 바이러스의 생산 감염을 차단하고 또한 세포 세포 독성 6 유발 수 있습니다. 이 프로토콜의 디메틸 sulfoxide의 사용의 배제 따라서이 가능성을 감소. 알렉사 플루어의 염료가 우수한 photostability을 가지고 있으며 세포 이해와 바이러스의 endosomal 교통 연구에 이상적, 낮은 산도에 민감한 등 플루오레신와 rhodamine이 같은 일반적인 염료보다됩니다. 알렉사 플루어 염료의 활용은 바이러스 특정 항체 및 호스트 세포 7의 putative 수용체에 의해 표시 뎅그열 바이러스의 인식에 영향을주지 않았다. 이 방법은 virological 공부에 유용한 응용 프로그램을 수 있습니다.
Protocol
1. 뎅그열 바이러스의 알렉사 플루어 라벨링 라벨 반응하기 전에, 자당 쿠션과 뎅그열 바이러스를 정화하고 같은 프로토콜에 표시된 필요한 시약과 장비를 준비합니다. 라벨 및 필터 주사기 0.2μm 필터를 소독 바로 앞에 신선한 0.2M 나트륨 중탄산염 버퍼, pH를 8.5 (라벨 버퍼) 및 히드록 실 아민 1.5M 버퍼, 산도 8.3을 (시약을 중지) 준비합니다. 2ml 튜브에 버퍼를 라벨링의 1ml에 ?…
Discussion
AF594 염료가이 보고서에 사용했지만, 알렉사 플루어 succinimidyl의 에스테르 시리즈 fluorophores 다양한 유사한 상표 화학 사용할 수 있습니다. 이 영상 이외 라벨 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다. 유동세포계측법는 흥분과 외과 기계가 감지할 수 fluorophores에 대한 상표의 정도를 계산하는 공촛점 현미경의 대안으로 사용할 수 있습니다.
알렉사 플루어의 염료는 무료 아미노 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 의학 연구위원회, 싱가포르에 의해 재정 지원되었다.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments (optional)
Sodium bicarbonate
Sigma-Aldrich
S6297
Hydroxylamine
Sigma-Aldrich
159417
Sodium hydroxide
Merck
106498
AF594 succinimidyl esters
Molecular Probes, Invitrogen
A20004
PD-10 column
GE Healthcare
17-0851-01
Hepes
Sigma-Aldrich
H6147
NaCl
Sigma-Aldrich
S3014
EDTA
Sigma-Aldrich
E9884
M-199
Invitrogen
11150
FBS
Hyclone
SH30070.03
4-well plate
Nunc
176740
Coverslips
Einst
0111520
Microscope slide
Sail Brand
7105
3H5 hybridoma
ATCC
HB46
10x PBS
1st Base
BUF-2040-10X1L
Saponin
Sigma-Aldrich
S4521
BSA
Sigma-Aldrich
A7906
Magnesium chloride
Sigma-Aldrich
M2670
Calcium chloride
Sigma-Aldrich
C3306
Paraformaldehye
Sigma-Aldrich
15,812-7
Mowiol 4-88
Calbiochem
475904
Dabco
Sigma-Aldrich
D27802
Tabletop centrifuge
Eppendorf
5424
Confocal microscope
Zeiss
LSM 710
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette.Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).