Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling
Summary
Profiterend van de vooruitgang in de ontwikkeling fluorofoor en imaging technologie, een eenvoudige methode van Alexa Fluor etikettering van dengue virus was ontwikkeld om het begin van de interacties tussen virus en cel visualiseren.
Abstract
De vroege gebeurtenissen in de interactie tussen virus en cel kan hebben grote invloed op de uitkomst van de infectie. Het bepalen van de factoren die deze interactie van invloed zou kunnen leiden tot een beter begrip van de ziekte pathogenese en dus invloed vaccins of therapeutische design. Daarom zou de ontwikkeling van methoden om deze interactie probe nuttig zijn. Recente ontwikkelingen in fluoroforen ontwikkeling 1-3 en imaging technologie 4 kan worden benut om onze huidige kennis over dengue pathogenese te verbeteren en zo de weg vrijmaken voor de miljoenen van dengue besmettingen per jaar te verminderen.
De omhulde dengue-virus heeft een externe steiger bestaat uit 90 enveloppe glycoproteïne (E)-dimeren de bescherming van de nucleocapside shell, die een enkele positieve streng RNA genoom 5 bevat. De identieke eiwitsubeenheden op het virus oppervlak kan dus worden voorzien van een amine reactieve kleurstof en gevisualiseerd door middel van immunofluorescentie microscopie. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de etikettering van dengue virus met Alexa Fluor succinimidylester kleurstof direct opgelost in een natriumbicarbonaat buffer die zeer levensvatbaar virus leverde na labeling. Er is geen gestandaardiseerde procedure voor de etikettering van levend virus en bestaande fabrikant protocol voor het eiwit labeling meestal de reconstructie van kleurstof in dimethylsulfoxide vereist. De aanwezigheid van dimethylsulfoxide, zelfs in kleine hoeveelheden, kan blokkeren productieve infectie van het virus en ook leiden tot cel cytotoxiciteit 6. De uitsluiting van het gebruik van dimethylsulfoxide in dit protocol zo beperkt deze mogelijkheid. Alexa Fluor kleurstoffen hebben superieure fotostabiliteit en zijn minder pH-gevoelig dan de gewone kleurstoffen, zoals fluoresceïne en rhodamine 2, waardoor ze ideaal zijn voor het onderzoek naar cellulaire opname en endosomale transport van het virus. De vervoeging van Alexa Fluor kleurstof had geen invloed op de opname van gelabelde dengue-virus door virus-specifieke antilichamen en zijn vermeende receptoren in gastheercellen 7. Deze methode zou kunnen hebben nuttige toepassingen in virologische studies.
Protocol
Discussion
Hoewel AF594 kleurstof werd gebruikt in dit rapport, een brede waaier van fluoroforen in de Alexa Fluor succinimidyl esters serie is leverbaar met vergelijkbare etikettering chemie. Dit kan uitbreiding van de etikettering van toepassing buiten beeldvorming. Flowcytometrie kan worden gebruikt als een alternatief voor de confocale microscopie voor het schatten van de mate van etikettering voor fluoroforen die kunnen worden opgewonden en gedetecteerd door de FACS apparaat.
Alexa Fluor kleurstof…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de National Medical Research Council, Singapore.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- . . Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
