לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג
Summary
ניצול של התקדמות בפיתוח fluorophore ואת טכנולוגיית הדמיה, שיטה פשוטה של אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה תוכננה כדי לחזות את האינטראקציות המוקדמות בין וירוס לתא.
Abstract
האירועים בתחילת האינטראקציה בין הנגיף לתא יכולה להיות השפעה רבה על התוצאה של זיהום. קביעת הגורמים המשפיעים על האינטראקציה הזאת יכולה להוביל להבנה משופרת של הפתוגנזה במחלה ובכך להשפיע על החיסון או עיצוב טיפולית. לפיכך, פיתוח של שיטות בדיקה זו אינטראקציה יהיה שימושי. הפיתוחים האחרונים fluorophores בפיתוח טכנולוגיית הדמיה 1-3 ו 4 ניתן לנצל כדי לשפר את הידע הנוכחי שלנו על הפתוגנזה דנגה, ובכך לסלול את הדרך כדי להפחית את מיליוני זיהומים דנגה המתרחשים מדי שנה.
וירוס דנגה אפוף יש פיגום חיצונית המורכבת 90 גליקופרוטאין המעטפה (E) הדימרים להגן על הקליפה nucleocapsid, אשר מכיל גדיל RNA חיובי יחיד בגנום 5. יחידות משנה החלבון זהה על פני הווירוס ולכן יכול להיות מתויג עם צבע תגובתי אמין ו דמיינו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescent. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה של תיוג של וירוס דנגה עם אלקסה פלואוריד succinimidyl אסתר צבע מומס ישירות חיץ סודיום ביקרבונט שהניבו וירוס קיימא מאוד לאחר תיוג. אין הליך סטנדרטי עבור תיוג של נגיף חי פרוטוקול היצרן הקיימים תיוג חלבון בדרך כלל דורש את הכינון מחדש של צבע בתוך sulfoxide דימתיל. הנוכחות של sulfoxide דימתיל, אפילו בכמויות מזעריות, יכול לחסום זיהום פרודוקטיבי של הנגיף וגם לגרום cytotoxicity תא 6. הדרה של השימוש sulfoxide דימתיל בפרוטוקול זה ובכך לצמצם את האפשרות הזאת. אלקסה צבעים פלואוריד יש photostability מעולה פחות pH רגיש יותר צבעים נפוצים, כגון והעמסת ו rhodamine 2, מה שהופך אותם אידיאליים עבור מחקרים על ספיגת הסלולר תחבורה endosomal של הנגיף. נטיה של אלקסה פלואוריד לצבוע לא השפיע על זיהוי של וירוס דנגה שכותרתו ידי נוגדן וירוסים ספציפיים קולטנים המשוערת שלה בתאים לארח 7. שיטה זו יכולה להיות יישומים שימושיים במחקרים virological.
Protocol
Discussion
למרות AF594 לצבוע שימש בדוח זה, מגוון רחב של fluorophores בסדרת פלואוריד אלקסה אסטרים succinimidyl זמין כימיה עם תיוג דומה. זה יכול להרחיב את היישום תיוג מעבר הדמיה. Cytometry זרימת יכול לשמש כחלופה מיקרוסקופיה confocal להערכת מידת תיוג עבור fluorophores שניתן נרגש זוהה על ידי מכונת FACS.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו כבר מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- . . Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
