Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.
El mesenterio rata adulta ventana de ensayo de la angiogénesis es biológicamente adecuado y está excepcionalmente bien adaptado para el estudio de brotes angiogénesis in vivo [ver artículos de revisión], que es la forma dominante de la angiogénesis en los tumores y tejidos humanos no tumorales, como se discutió en la revisión de invitados artículos 1,2. Angiogénesis inducida en las partes mesentérica membranosa por vía intraperitoneal (ip) la inyección de un factor pro-angiogénico puede ser modulada por vía subcutánea (sc), por vía intravenosa (iv) u oral (po) el tratamiento con agentes modificadores de la elección. Cada parte membranosa del mesenterio es transparente y enmarcado por el tejido adiposo, dándole una apariencia similar a la ventana.
El ensayo tiene las características ventajosas siguientes: (i) el tejido vascularizado prueba de forma nativa, aunque poco, y ya que es muy delgada, la red de microvasos es prácticamente bidimensional, que permite a toda la red para ser evaluados microscópicamente in situ; ( ii) en ratas adultas del tejido prueba carece de la angiogénesis fisiológica importante, que caracteriza a la mayoría de los tejidos normales de los mamíferos adultos, el grado de vascularización materna es, sin embargo, en correlación con la edad, como se discutió en una, (iii) el nivel insignificante de la angiogénesis inducida por el trauma asegura una alta sensibilidad, (iv) el ensayo reproduce la situación clínica, como los medicamentos de prueba de la angiogénesis modulación se administran por vía sistémica y las respuestas observadas reflejan el efecto neto de todos los metabólicos, celulares y alteraciones moleculares inducidos por el tratamiento; (v) el ensayo permite la evaluación de los objetivos, las variables cuantitativas, sin prejuicios de la extensión espacial microvascular, la densidad y la formación de patrones de la red, así como de brotes capilares, lo que permite robusto análisis estadísticos de la relación dosis-efecto y molecular relaciones estructura-actividad, y (vi ) el ensayo pone de manifiesto con una alta sensibilidad a los efectos tóxicos o perjudiciales de los tratamientos en términos de disminución de la tasa fisiológica del peso corporal, como las ratas adultas creciendo sólidamente.
Mastocitos mediada por la angiogénesis se demostró por primera vez utilizando este ensayo 3,4. El modelo muestra un alto nivel de discriminación respecto a los efectos de dosis-relaciones y los efectos medidos de la administración sistémica de química ni funcionalmente medicamentos estrechamente relacionados y las proteínas, incluyendo: (i) de baja dosis, administrada metronomically quimioterapéuticos estándares que producen diversos efectos específicos de drogas (es decir, las actividades de la angiogénesis-supresores, neutral o estimular la angiogénesis-5), (ii) naturales de hierro-insaturados lactoferrina humana, que estimula el VEGF-A la angiogénesis mediada por 6, y natural de hierro-insaturados lactoferrina bovina, lo que inhibe el VEGF-A- angiogénesis mediada por 7, y (iii) de bajo peso molecular fracciones de heparina producida por diversos medios 8,9. Por otra parte, el ensayo resulta muy adecuado para los estudios de los efectos combinados de la angiogénesis de los agentes que se administran por vía sistémica en forma simultánea o secuencial.
La idea de hacer este video se originó a partir de finales de los años el doctor Judah Folkman, cuando visitó nuestro laboratorio y fue testigo de la metodología que se ha demostrado.
Revisión de los documentos (invitado) discutir y evaluar el ensayo
Norrby, K. En los modelos in vivo de la angiogénesis. J. Cell. Mol. Medicina 10, 588-612 (2006).
Norrby, las pruebas con modelos K. Drogas angiogénesis. Opin experto. De drogas. Descubrimiento. 3, 533 a 549 (2008).
El ensayo fue presentado en 1986 3 y sucesivamente ha sido desarrollado y perfeccionado en el laboratorio 7,10-12. Como se discutió en los documentos de revisión (invitado) 1, 2, el ensayo se compara bien con otros mamíferos en el ensayo de angiogénesis in vivo en lo que se refiere en particular a las características importantes tales como el tejido de la prueba para adultos es de forma nativa vascularizado y carece de la angiogénesis fisiológica, un traumatismo mínimo, en su caso, se infligidos a los tejidos, y las variables cuantitativas se miden realmente, lo que permite el análisis de estadística sólida relación dosis-respuesta y los estudios moleculares de actividad, la angiogénesis brote ocurre, que es predominante en los tejidos normales y tumores, y los datos de toxicidad se acumula fácilmente en las ratas que crecen robustamente fisiológicamente en la edad adulta. Características desfavorables pueden incluir el hecho de que el ensayo es relativamente lento, especialmente cuando se evalúa el número y la longitud de los segmentos individuales de microvasos y los brotes de microvasos, que no permite observaciones real-time/serial, y que no es adecuado para ratones ya que muchas ventanas mesentérica en ratones carecen de microvasos potenciales padres de nuevos capilares que se pueden originar.
Observaciones en tiempo real, sin embargo, posible gracias a la microscopía intravital donde las ventanas mesentérica exteriorizado, pero intacta, son extendidas a lo largo de una platina del microscopio, mientras que el animal esté anestesiado, como se indica en 1.
Avances significativos en la investigación de la angiogénesis se han logrado en las últimas décadas el uso de modelos como el micropocket la córnea, la membrana corioalantoidea de pollo, y sc ensayos plug Matrigel, que son herramientas útiles, pero limitado en última instancia. Futuras aplicaciones clínicas de terapias anti-angiogénicas y pro-angiogénicos requieren el establecimiento y validación de los más sensibles y relevantes biológicamente, verdaderamente cuantitativa modelos preclínicos, como la descrita en el informe actual.
The authors have nothing to disclose.
Apoyo financiero para la mayoría de los estudios fue proporcionado por el Consejo Sueco de Investigación Médica (subvención 5942).
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
Catalog # | ARU0181 |
Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)