Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.
O adulto de ratos mesentério ensaio angiogênese janela é biologicamente apropriada e é excepcionalmente adequado para o estudo de germinação angiogênese in vivo [ver artigos de revisão], que é a forma dominante de angiogênese em tumores humanos e não-tecidos tumorais, como discutido na revisão solicitada papers 1,2. Angiogênese induzida nas partes membranosas mesentérica por injeção intraperitoneal (ip) de um fator pró-angiogênico pode ser modulada por via subcutânea (sc), intravenosa (iv) ou oral (po) o tratamento com agentes modificadores de escolha. Cada parte membranosa do mesentério é translúcido e emoldurado por tecido adiposo, dando-lhe uma aparência janela-like.
O ensaio tem as seguintes características vantajosas: (i) o tecido de teste é nativamente vascularizado, apesar da baixa densidade, e uma vez que é extremamente fina, a rede microvascular é praticamente bidimensional, que permite que toda a rede a ser avaliados microscopicamente in situ; ( ii) em ratos adultos o tecido teste carece de angiogênese fisiológica significativa, o que caracteriza a maioria dos adultos normais tecidos de mamíferos, o grau de vascularização nativa é, no entanto, correlacionada com a idade, como discutido no 1; (iii) o nível insignificante de trauma angiogênese induzida garante alta sensibilidade; (iv) o ensaio reproduz a situação clínica, como as drogas angiogênese modulador de teste são administrados por via sistémica e as respostas observadas refletem o efeito líquido de todos os metabólica, celular e alterações moleculares induzidas pelo tratamento, (v) o ensaio permite avaliações de objetivo, quantitativo, variáveis imparciais sobre extensão espacial microvascular, densidade e formação de padrões de rede, bem como de germinação capilar, permitindo assim robusta análises estatísticas da dose-efeito e molecular relações estrutura-actividade, e (vi ) o ensaio revela com alta sensibilidade aos efeitos tóxicos ou nocivos dos tratamentos em termos de diminuição da taxa de ganho de peso-fisiológicos, como ratos adultos crescer robustamente.
Mast-mediada por células angiogênese foi demonstrada pela primeira vez com este ensaio 3,4. O modelo demonstra um alto nível de discriminação em relação dose-efeito e os efeitos medidos administrada sistemicamente quimicamente ou funcionalmente drogas intimamente relacionados e proteínas, incluindo: (i) de baixa dosagem, administrada metronomicamente quimioterápicos padrão que produzem diversos, drogas efeitos específicos (isto é, atividades angiogênese-supressiva, neutro ou angiogênese estimulante 5), (ii) natural de ferro-insaturados lactoferrina humana, o que estimula VEGF-A-angiogênese mediada 6, e natural de ferro-insaturados lactoferrina bovina, que inibe o VEGF-A- angiogênese mediada 7, e (iii) as frações de baixo peso molecular, a heparina produzida por vários meios 8,9. Além disso, o ensaio é altamente adequado para estudos dos efeitos combinados sobre a angiogênese de agentes que são administrados por via sistémica, de forma concomitante ou seqüencial.
A idéia de fazer este vídeo originou-se do falecido Dr. Judah Folkman, quando visitou nosso laboratório e testemunhou a metodologia que está sendo demonstrada.
Revisão papers (convidados) discutindo e avaliando o ensaio
Norrby, K. Em modelos in vivo da angiogênese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. O teste de drogas com modelos de angiogênese. Especialista Opin. Drogas. Descoberta. 3, 533-549 (2008).
O ensaio foi introduzida em 1986 3 e tem sido sucessivamente desenvolvidos e aperfeiçoados em nosso laboratório 7,10-12. Como discutido em artigos de revisão (convidado) 1, 2, o ensaio compara bem com outros mamíferos ensaio in vivo de angiogênese em consideração, nomeadamente, características importantes, como o tecido teste adultos é nativamente vascularizado e carece de angiogênese fisiológica; trauma mínimo, se houver, é infligida ao tecido; variáveis quantitativas realmente são medidos, o que permite análise estatística de som em relação dose-resposta e atividade molecular estudos; angiogênese surgimento ocorre, que é predominante em tecidos normais e tumores, e dados de toxicidade são facilmente acumulada em ratos que crescer robustamente fisiologicamente na idade adulta. Características desfavoráveis podem incluir o fato de que o ensaio é relativamente demorado, especialmente quando se avalia o número ea duração de segmentos individuais microvascular microvascular e brotos, que não permite observações real-time/serial, e que dificilmente é adequado para ratos uma vez que muitas janelas mesentérica em ratos falta microvasos pai potencial a partir do qual pode originar novos capilares.
Observações em tempo real, no entanto, habilitado por microscopia intravital onde as janelas exteriorizado, mas ainda intacta mesentérica estão espalhados ao longo de um estágio do microscópio enquanto o animal é anestesiado, como discutido na 1.
Avanços significativos na pesquisa da angiogênese foram alcançados nas últimas décadas com modelos como o micropocket da córnea, membrana pinto corioalantóicas e ensaios plug-sc Matrigel, que são ferramentas úteis, mas, em última análise limitada. Futuras aplicações clínicas de terapias anti-angiogênicos e pró-angiogênico exigir o estabelecimento e validação de mais sensível e biologicamente relevantes, verdadeiramente quantitativa modelos pré-clínicos, como o descrito no relatório atual.
The authors have nothing to disclose.
Apoio financeiro para a maioria dos estudos foi fornecido pelo sueco Medical Research Council (concessão 5942).
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
Catalog # | ARU0181 |
Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)