הרקמות מבוגר vascularized יונקים כי חסרה אנגיוגנזה פיזיולוגי שלא נחשף התערבות כירורגית משמש המחקר: (i) ייזום ופיתוח של אנגיוגנזה הבאים הממשל intraperitoneal של סוכני הבדיקה; (ii) שינוי של אנגיוגנזה הבאים מערכתית של הממשל נבחרת סוכני הבדיקה.
העכברוש מבוגר mesentery חלון assay אנגיוגנזה מתאים מבחינה ביולוגית מתאים באופן יוצא מן הכלל ללימוד הנבטה אנגיוגנזה in vivo [ראו ניירות ביקורת], המהווה את טופס שולט של אנגיוגנזה בגידולים אנושיים שאינם סרטניים ברקמות, כפי שפורט ביקורת מוזמן ניירות 1,2. אנגיוגנזה המושרית בחלקים mesenteric קרומי בזריקה (IP) intraperitoneal של גורם הפרו angiogenic יכול להיות מווסתת על ידי תת עורית (SC), תוך ורידי (iv) או דרך הפה (PO) טיפול עם סוכני שינוי של בחירה. כל חלק של קרומי mesentery הוא שקוף ממוסגר על ידי רקמת שומן, זה נותן מראה חלון דמוי.
Assay יש את התכונות יתרון הבאים: (i) את הרקמה הבדיקה vascularized מקורי, אם כי בדלילות, ומאז הוא דק מאוד, רשת microvessel הוא כמעט דו מימדי, אשר מאפשר את הרשת כולה כדי להעריך מיקרוסקופית באתרו: ( ii) בחולדות המבוגר רקמות מבחן חסר אנגיוגנזה פיזיולוגי משמעותי, המאפיינת נורמלי ביותר ברקמות יונקים בוגרים, מידת כלי הדם המקומיים, עם זאת, בקורלציה עם הגיל, כפי שפורט 1 (iii) את רמת זניח של אנגיוגנזה טראומה הנגרמת מבטיחה רגישות גבוהה, (iv) assay משכפל את המצב הקליני, כפי אנגיוגנזה-ויסות תרופות הבדיקה ניתנות מערכתית ותגובות הנצפה משקף את ההשפעה נטו של כל חילוף החומרים, הסלולר, ושינויים מולקולריים הנגרמת על ידי הטיפול, (v) assay מאפשר הערכות אובייקטיביות, משתנים כמותיים משוחדת של הרחבה מרחבית צפיפות כלי הדם, דפוס הקמת הרשת, כמו גם של נימי הנבטה, ובכך מאפשרים ניתוחים סטטיסטיים חזקים של השפעה במינון מולקולרית מבנה פעילות יחסי; (ו ) assay מגלה עם רגישות גבוהה את ההשפעות הרעילות של טיפולים או מזיק במונחים של שיעור ירידה של הגוף לצבור משקל פיזיולוגי, כמו חולדות מבוגר לגדול וחסונה.
תורן תאים בתיווך אנגיוגנזה הודגם הראשון באמצעות assay זה 3,4. המודל מדגים רמה גבוהה של הפליה לגבי המינון אפקט היחסים ואת ההשפעות של נמדדת באופן מערכתי כימית או תפקודית תרופות וחלבונים קשורה קשר הדוק, כולל: (i) במינון נמוך, מנוהל כמו מטרונום chemotherapeutics סטנדרטי תשואה מגוונים, תרופה ספציפית השפעות (כלומר, פעילויות אנגיוגנזה-מדכאים, ניטרלי או אנגיוגנזה מגרה 5), (ii) טבעי ברזל בלתי רוויות לקטופרין אנושי, המעורר VEGF-A-6 אנגיוגנזה בתיווך, וטבעי ברזל בלתי רוויות שור לקטופרין, אשר מעכב VEGF-A- אנגיוגנזה בתיווך 7; (iii) נמוך משקל מולקולרי שברים הפרין המיוצר על ידי אמצעים שונים 8,9. יתר על כן, assay הוא מתאים מאוד מחקרים על ההשפעות המשולבות על אנגיוגנזה של סוכנים אשר מנוהלים בצורה מערכתית במקביל או רציפים.
הרעיון של הפיכת הווידאו הזאת שמקורה המנוח ד"ר יהודה פולקמן כאשר ביקר במעבדה שלנו עדים מתודולוגיה שמפגינים.
סקירת עיתונים (מוזמן) לדיון בהערכת assay
Norrby, ק במודלים vivo של אנגיוגנזה. J. Cell. מול. מד. 10, 588-612 (2006).
Norrby, בדיקות ק והתרופות עם מודלים אנגיוגנזה. מומחה Opin. והתרופות. וגיליתי. 3, 533-549 (2008).
Assay הוצג בשנת 1986 ויש לו 3 ברציפות פותחה עוד ומעודן במעבדה שלנו 7,10-12. כפי שנאמר בעיתונים ביקורת (מוזמן) 1, 2, assay משווה גם עם יונקים אחרים assay אנגיוגנזה vivo ביחס במיוחד תכונות חשובות כגון רקמת המבחן למבוגרים הוא מקורי vascularized וחסר אנגיוגנזה פיזיולוגי; טראומה מינימלית, אם בכלל, היא שנגרם לרקמות; משתנים כמותיים נמדדים באמת, המאפשר ניתוח סטטיסטי קול לגבי מנה תגובה ופעילות מולקולרית מחקרים; אנגיוגנזה נביטה מתרחשת, אשר predominating ברקמות גידולים רגילים; נתוני רעילות מצטברים בקלות חולדות לגדול וחסונה פיזיולוגית בבגרות. תכונות נחות עשוי לכלול את העובדה assay הוא יחסית זמן רב, במיוחד כאשר בהערכת מספר ואורך מקטעי microvessel הפרט נבטים microvessel, כי הוא אינו מאפשר תצפיות real-time/serial, וכי הוא מתאים כמעט עבור עכברים מאז חלונות mesenteric רבים בעכברים חוסר microvessels הורה פוטנציאל נימים חדש שממנו יכול לנבוע.
בזמן אמת תצפיות, עם זאת, מופעל על ידי מיקרוסקופיה intravital שבו חלונות mesenteric exteriorized אבל שלמים הם פרושות מעל הבמה מיקרוסקופ בעוד החיה מורדמת, כפי שפורט 1.
התקדמות משמעותית במחקר אנגיוגנזה הושגו בעשורים האחרונים באמצעות מודלים כגון micropocket הקרנית, קרום חומוס chorioallantoic ו sc מבחני Matrigel תקע, אשר הם כלי שימושי אבל בסופו של דבר מוגבל. יישומים קליניים עתידיים של טיפולים אנטי angiogenic ופרו angiogenic מחייבים הקמת ואימות של יותר רגיש ורלוונטי מבחינה ביולוגית, טרום קליניים במודלים כמותיים באמת, כמו זה המתואר בדו"ח הנוכחי.
The authors have nothing to disclose.
תמיכה כספית עבור רוב המחקרים סופק על ידי המועצה למחקר רפואי שוודית (מענק 5942).
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
Catalog # | ARU0181 |
Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)