Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre
Summary
Um<em> In vivo</em> Método para testar a função do gene no cérebro pós-natal é descrito. AAVs recombinante expressando Cre e / ou uma proteína fluorescente são injetadas no cérebro de rato neonatal. Inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsos são alcançados, permitindo a análise rápida da função dos genes em processos críticos para o desenvolvimento do circuito neural.
Abstract
Função normal do cérebro depende não só no desenvolvimento embrionário quando principais vias neuronais são estabelecidas, mas também sobre o desenvolvimento pós-natal quando os circuitos neurais são vencidas e refinado. Desregulação nesta fase pode levar a distúrbios neurológicos e psiquiátricos, como autismo e esquizofrenia 1,2. Muitos genes foram estudados no cérebro pré-natal e encontrou crucial para muitos processos de desenvolvimento 3-5. No entanto, sua função no cérebro pós-natal é em grande parte desconhecida, em parte porque sua eliminação em ratos muitas vezes leva a letalidade durante o desenvolvimento neonatal, e em parte porque sua exigência no início do desenvolvimento dificulta a análise pós-natal. Para superar esses obstáculos, os alelos floxed desses genes estão sendo gerados em camundongos 6. Quando combinado com alelos transgênicos que expressam Cre recombinase em tipos específicos de células, eliminação condicional pode ser alcançado para estudar a função do gene no cérebro pós-natal. No entanto, este método requer alelos adicionais e tempo extra (3-6 meses) para gerar os ratos com genótipos adequados, limitando assim a expansão da análise genética para grande escala no cérebro do rato.
Aqui nós demonstramos uma abordagem complementar que usa Cre virally-expresso para o estudo desses alelos floxed rápida e sistematicamente no desenvolvimento do cérebro pós-natal. Injetando recombinante vírus adeno-associado (rAAVs) 7,8 codificação Cre no cérebro neonatal, somos capazes de eliminar o gene de interesse em diferentes regiões do cérebro. Ao controlar o título viral e coexpressing um marcador da proteína fluorescente, que pode assegurar em simultâneo a inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsas. Este método ignora a exigência de muitos genes no início do desenvolvimento, e nos permite estudar a sua função de células autônomas em muitos processos críticos no desenvolvimento do cérebro pós-natal, incluindo o crescimento axonal e dendrítico, ramificação e azulejos, bem como a formação de sinapses e requinte. Este método tem sido utilizado com sucesso em nosso próprio laboratório (dados não publicados) e outros 8,9, e pode ser estendido a outros vírus, como lentivírus 9, bem como a expressão de shRNA ou dominante proteínas ativas 10. Além disso, ao combinar esta técnica com eletrofisiologia, bem como recém-desenvolvidas ferramentas de imagem óptico de 11, este método fornece uma nova estratégia para estudar como as vias genéticas influenciam o desenvolvimento do circuito neural e função em camundongos e ratos.
Protocol
Discussion
O método de injeção neonatal viral apresentado aqui fornece uma maneira simples e rápida de gerar em mosaicos vivo para o estudo do desenvolvimento do cérebro pós-natal. O método aproveita floxed alelos que estão atualmente disponíveis, bem como aqueles que estão sendo feitas através do Gene High Throughput Segmentação do projeto 6. Comparado ao uso da expressão transgênica de Cre, este método fornece uma maneira rápida de testar a função do gene em vários tipos celulares…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por uma bolsa de RO1 NIH (NINDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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