Summary

Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre

Published: August 01, 2011
doi:

Summary

Un<em> In vivo</emMetodo> per testare la funzione del gene nel cervello postnatale è descritto. AAVs ricombinanti che esprimono Cre e / o di una proteina fluorescente vengono iniettate nel cervello di topo neonatale. L'inattivazione del gene mosaico e rada etichettatura neuronali siano raggiunti, consentono una rapida analisi della funzione del gene nei processi critici per lo sviluppo del circuito neurale.

Abstract

Normali funzioni cerebrali si basa non solo sullo sviluppo embrionale in cui i principali percorsi neuronali sono stabiliti, ma anche sullo sviluppo postnatale, quando i circuiti neurali sono maturato e raffinato. Misregulation in questa fase può portare a disturbi neurologici e psichiatrici come l'autismo e la schizofrenia 1,2. Molti geni sono stati studiati nel cervello prenatale e ha trovato cruciali per molti processi di sviluppo 3-5. Tuttavia, la loro funzione nel cervello postnatale è in gran parte sconosciuto, anche perché la loro cancellazione in topi spesso conduce a mortalità durante lo sviluppo neonatale, e in parte perché la loro richiesta nel primo sviluppo ostacola l'analisi post-natale. Per superare questi ostacoli, floxed alleli di questi geni sono attualmente generati nei topi 6. Se combinato con alleli transgenici che esprimono Cre ricombinasi in tipi cellulari specifici, la cancellazione condizionale può essere raggiunto per studiare la funzione dei geni nel cervello postnatale. Tuttavia, questo metodo richiede alleli aggiuntivi e tempi supplementari (3-6 mesi) per generare i topi con genotipi del caso, limitando così l'espansione della analisi genetica di larga scala nel cervello di topo.

Qui mostriamo un approccio complementare che utilizza virale Cre-espresso per studiare questi alleli floxed rapidamente e sistematicamente nello sviluppo cerebrale postnatale. Iniettando ricombinante virus adeno-associati (rAAVs) 7,8 codifica Cre nel cervello neonatale, siamo in grado di eliminare il gene di interesse in diverse regioni del cervello. Controllando il titolo virale e coexpressing un marcatore fluorescente proteina, siamo in grado di raggiungere contemporaneamente l'inattivazione del gene mosaico e sparse etichettatura neuronale. Questo metodo evita l'esigenza di molti geni nello sviluppo iniziale, e ci permette di studiare la loro funzione autonoma delle cellule in molti processi critici nello sviluppo cerebrale postnatale, compresa la crescita assonale e dendritiche, ramificazione, e rivestimenti, come pure la formazione di sinapsi e raffinatezza. Questo metodo è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio proprio (risultati non pubblicati) e altri 8,9, e può essere esteso ad altri virus, come il lentivirus 9, così come l'espressione di shRNA o dominante proteine ​​attive 10. Inoltre, combinando questa tecnica con elettrofisiologia così come recentemente sviluppato strumenti di imaging ottico 11, questo metodo fornisce una nuova strategia per studiare come i percorsi genetici influenzano lo sviluppo neurale del circuito e la funzione di topi e ratti.

Protocol

1. Virus preparazione iniettabile rAAVs sono stati acquistati dal produttore raccomanda commerciale, ma possono anche essere prodotta nel proprio laboratorio proprio (vedi discussione sotto). La soluzione del virus è tipicamente prodotta in un titolo di ~ 1×10 12 copie per millilitro genoma (GC / ml) e può essere utilizzato a pieno titolo a manipolare un gran numero di cellule. In alternativa, possono essere diluiti per produrre il livello desiderato di etichettatura sparse. La diluizione appropr…

Discussion

Il metodo neonatale iniezione virale qui presentata fornisce un modo semplice e rapido per generare mosaici in vivo per lo studio dello sviluppo cerebrale postnatale. Il metodo si avvale di alleli floxed che sono attualmente disponibili e quelle che vengono effettuate tramite il gene targeting High Throughput progetto 6. Rispetto all'uso di espressione transgenica di Cre, questo metodo fornisce un modo rapido per testare la funzione del gene in vari tipi di cellule, come topi portatori degli alle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è finanziato da una sovvenzione RO1 dal NIH (NINDS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, Vector Biolabs #7060, #7061, custom order http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pump 11 Plus Harvard Apparatus #702208 (No foot pedal port)
Retinal Pigment Epithelium Injection Kit World Precision Instruments RPE-KIT Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder
NanoFil Syringe, 100μl World Precision Instruments NANOFIL-100 Includes reusable loading needle
D-PBS Invitrogen 14040-117  
GFP antibody Aves GFP-1020  
DsRed antibody Clontech 632496  
Heating Block VWR 97042-610  
ROSA26R mouse Jackson Laboratory 003309  

References

  1. Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
  2. Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
  3. Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  4. Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  5. Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
  6. Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
  7. Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
  8. Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
  9. Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
  10. Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
  11. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
  12. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
  13. Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
  14. Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).

Play Video

Cite This Article
Gibson, D. A., Ma, L. Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination. J. Vis. Exp. (54), e2823, doi:10.3791/2823 (2011).

View Video