Analyse mosaïque de fonction des gènes dans le développement de cerveau de souris à l'aide postnatale à base de virus recombinaison Cre
Summary
Une<em> In vivo</em> Méthode pour tester la fonction des gènes dans le cerveau postnatal est décrite. AAV recombinants exprimant Cre et / ou une protéine fluorescente sont injectées dans le cerveau de souris néonatales. Inactivation d'un gène mosaïque et clairsemés étiquetage neuronale sont atteints, permettant une analyse rapide de la fonction des gènes dans les processus essentiels au développement des circuits neuronaux.
Abstract
Fonctionnement normal du cerveau repose non seulement sur le développement embryonnaire où les grandes voies neuronales sont établis, mais aussi sur le développement postnatal lorsque les circuits neuronaux sont élevés et raffinée. Le dérèglement à ce stade peut entraîner des troubles neurologiques et psychiatriques comme l'autisme et la schizophrénie 1,2. De nombreux gènes ont été étudiés dans le cerveau prénatal et trouve cruciale pour de nombreux processus développementaux 3-5. Cependant, leur fonction dans le cerveau postnatal est largement inconnu, en partie parce que leur suppression chez la souris conduit souvent à la létalité au cours du développement néonatal, et en partie parce que leur condition en début de développement entrave l'analyse post-natal. Pour surmonter ces obstacles, les allèles floxés de ces gènes sont actuellement générés chez des souris 6. Lorsqu'il est combiné avec des allèles transgéniques qui expriment la recombinase Cre dans des types cellulaires spécifiques, suppression conditionnelle peut être réalisé pour étudier la fonction des gènes dans le cerveau postnatal. Cependant, cette méthode nécessite allèles supplémentaires et du temps supplémentaire (3-6 mois) pour générer des souris avec des génotypes appropriés, limitant ainsi l'expansion de l'analyse génétique à grande échelle dans le cerveau de souris.
Ici nous démontrons une approche complémentaire qui utilise viro-Cre exprimée d'étudier ces allèles floxés rapidement et systématiquement dans le développement du cerveau postnatal. En injectant recombinant virus adéno-associés (rAAVs) 7,8 encodage Cre dans le cerveau néonatal, nous sommes capables de supprimer le gène d'intérêt dans les différentes régions du cerveau. En contrôlant le titre viral et la co-exprimant un marqueur fluorescent protein, nous pouvons atteindre simultanément l'inactivation du gène mosaïque et clairsemés étiquetage neuronale. Cette méthode contourne l'exigence de nombreux gènes dans le développement précoce, et nous permet d'étudier leur fonction de cellules autonomes dans de nombreux processus essentiel dans le développement du cerveau postnatal, y compris la croissance axonale et dendritique, de branchement, et le carrelage, ainsi que la formation des synapses et de raffinement. Cette méthode a été utilisée avec succès dans notre propre laboratoire (résultats non publiés) et d'autres 8,9, et peut être étendue à d'autres virus, tels que des lentivirus 9, ainsi que l'expression de shRNA ou dominant des protéines actives 10. Par ailleurs, en combinant cette technique avec l'électrophysiologie ainsi que récemment développé des outils d'imagerie optique 11, cette méthode fournit une nouvelle stratégie pour étudier comment les voies génétiques influencent le développement des circuits neuronaux et la fonction chez les souris et les rats.
Protocol
Discussion
La méthode d'injection néonatale virale présenté ici offre un moyen simple et rapide de générer des mosaïques in vivo pour l'étude du développement du cerveau postnatal. La méthode tire parti des allèles floxés qui sont actuellement disponibles ainsi que ceux qui sont faits par le gène High Throughput ciblage des projets 6. Comparé à l'utilisation de l'expression transgénique de la CRE, cette méthode fournit un moyen rapide de tester la fonction des gènes da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par une subvention du NIH RO1 (NINDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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