Summary

Rekombinant Çözünür GM-CSF Reseptör kullanarak GM-CSF Antikor Nötralizasyon Kapasitesi tahmin Hücre Testi Sistemi

Published: June 27, 2011
doi:

Summary

Hücre reseptör bağlayıcı tahlil reseptörlerine granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) bağlama tahmin etmek için tasarlanmıştır. Bu mükemmel tekrarlanabilirlik ile GM-CSF otoantikor çözünen GM-CSF reseptör alfa bağlayıcı biotinlenmiş GM-CSF yarışmalı inhibisyonu değerlendirmek için bize sağlar.

Abstract

ZEMİN: Daha önce, biz bu nötralize kapasitesi gösterdi ama GM-CSF otoantikor konsantrasyonu otoimmün pulmoner alveoler proteinozis (PAP) 1-3 olan hastalarda hastalığın şiddeti ile korelasyon. Akciğer GM-CSF biyoaktivite kaldırılması 4,5 otoimmün PAP için olası nedeni olarak, PAP ile her hastada hastalık şiddeti değerlendirmek için, GM-CSF otoantikorların nötralize kapasitesini ölçmek için umut verici .

Şimdiye kadar, GM-CSF otoantikorların nötralize kapasitesi, insan kemik iliği hücreleri ya da GM-CSF 6-8 ile uyarılan TF-1 hücreleri büyüme inhibisyonu değerlendirerek değerlendirilmiştir. Biyoassay sisteminde, ancak sabit bir durum hücrelerin korunmasında teknik zorluklar nedeniyle farklı laboratuvarlarda verileri karşılaştırmak için güvenilir verilerin yanı sıra, elde etmek için çoğu zaman sorunlu.

AMAÇ: GM-CSF hücre reseptör-bağlayıcı-assay kullanarak hücre yüzeyinde GM-CSF reseptör bağlayıcı taklit etmek için.

YÖNTEM: Transgenik ipekböceği teknolojisi, yüksek saflıkta 9-13 rekombinant çözünür, GM-CSF reseptör alfa (sGMRα) için büyük miktarda elde etmek için uygulandı. Rekombinant sGMRα ipek proteinleri erimiş olmadan ipek ipler hidrofilik serizin katmanlarda yer aldığını ve böylece, biz nötr sulu çözeltileri 14,15 ile kolayca iyi saflık koza elde edebilirsiniz. Neyse ki, GM-CSF ile bağlama için kritik olan oligosakkarit yapılar, diğer böcekler ya da mayalar tarafından üretilen dışında insan sGMRα yapılarını daha benzer.

Bulgular: sGMRα kullanarak hücre test sistemi, yüksek plastisite ve güvenilirliği ile veri vermiştir. SGMRα için bağlayıcı GM-CSF sGMRα kullanarak yeni hücre ücretsiz test sistemi nötralize aktivitesinin ölçümü için daha yararlı olduğunu belirterek, benzer bir şekilde TF-1 hücreleri kullanarak biyoassay poliklonal GM-CSF otoantikor tarafından inhibe doza bağımlı TF-1 hücre veya insan kemik iliği hücreleri kullanarak biyoassay sistemine göre GM-CSF otoantikorların.

Sonuç: GM-CSF otoantikor nötralize kapasitesi niceleme bir hücre ücretsiz tahlil kurdu.

Protocol

1. SGMRα üretimi ve saflaştırılması Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile insan plasenta cDNA kütüphanesi sGMRα, cDNA artırın. His-tag 3 'başka bir PCR PCR Amplikon sonuna kadar 50 baz bakülovirüs polyhedrin sonu 5'-UTR dizisi ve 27 baz kodlama RGS ekleyin. Çoğaltılan PCR ürününün bir plazmid pMSG1.1MG içine yerleştirin. Ipekböceği PND-w1 suşu yumurta içine pHA3PIG yardımcı vektörü ile yapı psGMR/M1.1MG enjekte edilir. 25 kelebekl…

Discussion

Hücre ücretsiz test GM-CSF otoantikorların mükemmel tekrarlanabilirlik ve hızla nötralize kapasitesi tahmin edilmektedir. GM-CSF otoantikorlar veya hastanın serum IgG kesirler bağlayıcı inhibisyon testi ile değerlendirildi. Veri hücre testinin bağlayıcı inhibisyonu ve TF-1 hücreleri, sırasıyla kullanarak biyoassay büyüme inhibisyonu arasında bir korelasyon gösterdi. Biyoassay yaygın olarak kullanılan, ancak farklı tesis ve biz bu yeni sistem kullanarak önleyebilirsiniz farklı zaman noktaları …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz, değerli katkılarından dolayı K. Nakagaki Dr H. Ishii, Dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa müteşekkiriz.

Materials

Name of reagent Company Catalog # Comments
human placenta cDNA library Takara
Nickel affinity column GE Healthcare 17-5247-01
biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) PIERCE 21339
rhGM-CSF (leukine) Genzyme Corporation
Nunc Immobilizer Amino Nalge Nunc International 436007
Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse Sigma-Aldrich H1029 0.2ml
blocking solution (StabilCoat) Surmodics SC01-1000 1000ml
ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate Invitrogen 43-8322
CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II Applied Biosystems T2214
chemiluminescence plate reader BERTHOLD TECHNOLOGIES TriStar LB 941

References

  1. Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
  2. Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
  3. Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
  4. Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
  5. Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
  6. Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
  7. Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
  8. Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
  9. Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
  10. Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5′-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
  11. Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
  12. Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  13. Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
  14. Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
  15. Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
  16. Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
  17. Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
  18. Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
  19. Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
  20. Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
  21. Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).

Play Video

Cite This Article
Urano, S., Tazawa, R., Nei, T., Motoi, N., Watanabe, M., Igarashi, T., Tomita, M., Nakata, K. A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor. J. Vis. Exp. (52), e2742, doi:10.3791/2742 (2011).

View Video