Бесклеточной системе Пробирной Оценка нейтрализующей способности ГМ-КСФ антител с использованием рекомбинантных растворимых ГМ-КСФ рецептор
Summary
Мы разработали бесклеточной связывание с рецепторами анализа для оценки связывания гранулоцитов и макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) с рецепторами. Это позволяет нам оценить конкурентного ингибирования биотинилированного GM-CSF связывания с растворимыми GM-CSF рецепторов альфа-ГМ-КСФ аутоантител с отличной воспроизводимости.
Abstract
ФОН: Ранее мы показали, что нейтрализующей способности, но не концентрации ГМ-КСФ аутоантител коррелирует с тяжестью заболевания у пациентов с аутоиммунными легочного альвеолярного протеиноз (PAP) 1-3. Как отмена GM-CSF биологическую активность в легких является вероятной причиной аутоиммунных PAP 4,5, это перспективное для измерения нейтрализующей способности ГМ-КСФ аутоантител для оценки тяжести заболевания у каждого пациента с PAP.
До сих пор, нейтрализующей способности ГМ-КСФ аутоантител была оценена путем вычисления замедление роста у человека клеток костного мозга или TF-1 клетки стимулировали ГМ-КСФ 6-8. В биопроб система, однако, часто бывает проблематично получить достоверные данные, а также сравнивать данные из различных лабораторий, в связи с техническими трудностями в поддержании клеток в постоянном состоянии.
ЦЕЛЬ: имитировать GM-CSF привязки к GM-CSF рецепторов на поверхности клетки использованием бесклеточных рецептор-связывающий-анализа.
Методы: Трансгенные шелкопряда технология применяется для получения большого количества рекомбинантных растворимых GM-CSF рецепторов альфа (sGMRα) с высокой чистоты 9-13. Рекомбинантный sGMRα содержится в гидрофильные слои серицина шелковых нитей, не будучи слит с протеинами шелка, и, таким образом, мы можем легко извлечь из коконов в хорошей чистоты с нейтральным водных растворах 14,15. К счастью, олигосахарид структур, которые имеют решающее значение для связывания с GM-CSF, больше похожи на структуры человеческого sGMRα, чем те, производимых другими насекомыми или дрожжей.
РЕЗУЛЬТАТЫ: бесклеточной анализа системы с помощью sGMRα дали данные с высокой пластичностью и надежности. GM-CSF привязки к sGMRα была дозозависимой ингибируется поликлональных GM-CSF аутоантител в подобной манере к биопроб использованием ТФ-1 клетках, что свидетельствует о нашей новой бесклеточной анализа системы с помощью sGMRα более полезно для измерения нейтрализующей активностью ГМ-КСФ аутоантител, чем системы с помощью биопроб TF-1 ячейки или человеческих клеток костного мозга.
Заключение: Мы созданы бесклеточной анализа количественного нейтрализующей способности ГМ-КСФ аутоантител.
Protocol
Discussion
Бесклеточной анализа оценкам нейтрализующей способности ГМ-КСФ аутоантител с отличной воспроизводимостью и быстротой. Обязательные ингибирования GM-CSF аутоантитела IgG или сыворотке пациента фракций оценивали результаты анализа. Данные показали корреляцию между обязательными тормож…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы очень благодарны К. Nakagaki, д-р Х. Ишии, д-р К. Судзуки, А. Ямагата, К. Oofusa за их ценный вклад.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5′-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
