Summary

Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor

Published: June 27, 2011
doi:

Summary

Se diseñó un ensayo de receptor de la célula-unión libre con el fin de estimar la unión de granulocitos y macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF) a los receptores. Que nos permite evaluar la inhibición competitiva de biotina GM-CSF unión a los receptores alfa soluble GM-CSF por GM-CSF autoanticuerpos con una excelente reproducibilidad.

Abstract

ANTECEDENTES: Anteriormente, hemos demostrado que la capacidad de neutralizar, pero no la concentración de GM-CSF autoanticuerpos se correlaciona con la severidad de la enfermedad en pacientes con proteinosis alveolar pulmonar autoinmune (PAP) 1-3. Como la derogación de GM-CSF en la bioactividad de pulmón es la causa probable de PAP 4,5 autoinmune, es prometedor para medir la capacidad de neutralización de anticuerpos GM-CSF para evaluar la gravedad de la enfermedad en cada paciente con PAP.

Hasta ahora, la capacidad de neutralización de anticuerpos GM-CSF ha sido evaluado mediante la evaluación de la inhibición del crecimiento de las células de la médula ósea o la TF-1 las células estimuladas con GM-CSF 6-8. En el sistema de bioensayo, sin embargo, es a menudo problemático obtener datos fiables, así como para comparar los datos de diferentes laboratorios, debido a las dificultades técnicas en el mantenimiento de las células en un estado constante.

OBJETIVO: Para imitar GM-CSF unión a receptores de GM-CSF en la superficie celular utilizando células libres de unión al receptor-ensayo.

Métodos transgénicos gusano de seda se ha aplicado la tecnología para la obtención de una gran cantidad de soluble recombinante alfa del receptor de GM-CSF (sGMRα) de alta pureza 13.09. El sGMRα recombinante estaba contenido en las capas sericina hidrofílico de hilos de seda sin ser fusionadas a las proteínas de la seda, y por lo tanto, es fácil extraer de los capullos de buena pureza con soluciones acuosas neutras 14,15. Afortunadamente, las estructuras de oligosacáridos, que son críticos para la unión con GM-CSF, son más similares a las estructuras de sGMRα humanos que las producidas por otros insectos o levaduras.

Resultados: El sistema de ensayo libre de células con sGMRα dado los datos con alta plasticidad y la fiabilidad. Unión a sGMRα GM-CSF fue dosis-dependiente inhibido por policlonal GM-CSF autoanticuerpos en una forma similar a los bioensayos con la TF-1 en las células, lo que indica que nuestra libre de células nuevo sistema de ensayo utilizando sGMRα es más útil para la medición de la actividad neutralizante de GM-CSF autoanticuerpos que el sistema de bioensayo con TF-1 de células o células humanas de médula ósea.

Conclusiones: Se estableció un ensayo libre de células cuantificar la capacidad de neutralización de GM-CSF autoanticuerpos.

Protocol

1. Producción y purificación de sGMRα Amplificar cDNA de sGMRα de placenta humana biblioteca de cDNA por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Añadir 50 bases 5'-UTR secuencia de final de baculovirus polihedrina y 27 RGS base de codificación de su etiqueta en el extremo 3 'a la amplificación de PCR por otro PCR. Inserte la amplificación de PCR en un pMSG1.1MG plásmido. Inyectar el psGMR/M1.1MG construir con el vector de ayuda pHA3PIG en los huevos de gusanos d…

Discussion

El ensayo libre de células calcula la capacidad de neutralización de GM-CSF autoanticuerpos con una excelente reproducibilidad y rapidez. La inhibición de la unión de GM-CSF o fracciones de autoanticuerpos en suero de los pacientes IgG se evaluó en este ensayo. Los datos mostraron una correlación entre la inhibición de la unión de la prueba libre de células y la inhibición del crecimiento de un bioensayo con células TF-1, respectivamente. El bioensayo ha sido ampliamente utilizado, pero albergaba las dificult…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos muy agradecidos a K. Nakagaki, el Dr. H. Ishii, el Dr. K. Suzuki, Yamagata A., Oofusa K. por su valiosa contribución.

Materials

Name of reagent Company Catalog # Comments
human placenta cDNA library Takara
Nickel affinity column GE Healthcare 17-5247-01
biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) PIERCE 21339
rhGM-CSF (leukine) Genzyme Corporation
Nunc Immobilizer Amino Nalge Nunc International 436007
Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse Sigma-Aldrich H1029 0.2ml
blocking solution (StabilCoat) Surmodics SC01-1000 1000ml
ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate Invitrogen 43-8322
CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II Applied Biosystems T2214
chemiluminescence plate reader BERTHOLD TECHNOLOGIES TriStar LB 941

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Urano, S., Tazawa, R., Nei, T., Motoi, N., Watanabe, M., Igarashi, T., Tomita, M., Nakata, K. A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor. J. Vis. Exp. (52), e2742, doi:10.3791/2742 (2011).

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