Inmunocitoquímica es un poderoso método para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitan una para conservar los anticuerpos y sacar el máximo provecho de su coloración.
Abstract
Inmunocitoquímica es un método muy eficaz y sencillo modo leal, para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés, por lo general una proteína, en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitirá a los investigadores para conservar anticuerpos primarios y secundarios al obtener alta calidad, de calidad reproducible y datos cuantitativos de sus manchas. Hay dos aspectos de este protocolo que ayuda a conservar el volumen de los anticuerpos necesarios para la tinción. Por un lado, las células se cultivaron en cubreobjetos pequeños y circulares que se colocan en pocillos de una placa de cultivo de tejidos. Después de la fijación, las células en cubreobjetos se puede quitar de los pozos de la placa. Para la tinción de anticuerpos, el cubreobjetos con las células se invierte en una pequeña gota de solución de anticuerpos en parafina y se cubre con una segunda pieza de parafilm para evitar que se sequen. El uso de este método, sólo aproximadamente 25 l de solución de anticuerpos que se necesita para cada cubreobjetos (o muestra) a teñir. Este protocolo describe la inmunotinción de los derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs), pero se puede utilizar para muchos tipos de células.
Protocol
Día 1: Preparación de las células Cubreobjetos de vidrio alemán y Siembra Nota: cubreobjetos de vidrio alemán son a menudo mejores para el cultivo de células madre neuronales primarias y las neuronas. Usamos el protocolo de limpieza siguientes para mejorar la adhesión celular y la difusión. Cubreobjetos posición en una parrilla pequeña que permitirá el acceso de líquido a ambos lados del cubreobjetos. En primer lugar, los cubreobjetos se incuban en el 1% Liquinox durante 1…
Discussion
Este protocolo describe un procedimiento de inmunotinción para hNSPCs que minimiza el volumen de los anticuerpos necesarios y da la tinción de células confiable. El procedimiento descrito es el mejor de los antígenos intracelulares, pero puede ser modificado para teñir las moléculas de la superficie celular o para mejorar la tinción del citoesqueleto.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital de Niños del Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar culturas hNSPC y el Dr. Gary Bassell la Universidad de Emory para la instrucción inicial en la técnica de tinción de parafina.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips
Tool
Carolina Biological Supply Company
WW-63-3029
12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent
Reagent
Sigma
Z273279
very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide
Reagent
Sigma
P7280
Laminin, natural mouse
Reagent
Invitrogen
23017-015
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate
Tool
Fisher
08-772-1
Triton X-100
Reagent
Fisher
BP151-500
very viscous
Paraformaldehyde
Reagent
Sigma
P6148
potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells.In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).